桂枝对mrl小鼠心肌细胞凋亡及caspase3基因表达的影响

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1、桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡及Caspase3基因表达的影响【关键词】MRL小鼠；细胞凋亡；Caspase3基因表达系统性红斑狼疮（Systemiclupuserythematosus,SLE）是一种多因素参与的累及全身多脏器、多系统的自身免疫性疾病，现代医学多采用肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、非甾体抗炎药等治疗，但有明显的副作用，停药后病情也易反复，治疗现状不容乐观。目前在中医中药领域内寻找治疗SLE及SLE心肌损害的有效药物，并从调控凋亡基因、抑制细胞凋亡切入研究其作用机理，是一项很有裨益的探索。本实验对MRL小鼠应用桂枝进行了该方面的探讨。　　1材料与仪器　　1

2、.1动物　　8～10周龄雌性MRL小鼠，体质量20～25g，由上海动物中心提供。　　1.2药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。　　1.3试剂RNA提取试剂TrizolReagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品；逆转录酶（AMV-RT），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase），随机引物（Randomprimers），琼脂糖（agarose）均购自美国Promega公司。　　1.4仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；GeneAmp9600

3、型PCR仪为美国PE公司生产；RS-28高速低温离心机为德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；UVP凝胶扫描系统由美国UVP公司生产；微量移液器为德国Gilson公司生产；DYZ-22A型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；DYY-Ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。　　2方法　　2.1实验分组与给药36只雌性MRL小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物

4、，取心室肌组织。　　2.2检测指标与方法　　2.2.1心肌细胞凋亡Ladder电泳用碱裂解法提取心肌ＭＤＡ,洗涤,ＴＥ过夜溶解。制备15%的琼脂糖凝胶，加入DNA样品，以5V/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察DNA条带，成像、照片。　　2.2.2凋亡及相关基因检测迅速分离心脏,常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核的3’末端。分离MRL小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，

5、M-Caspase3基因按照相应的RT-PCR实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含GoldViein，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-ProAnalyzerVersion3.0）分析结果。　　2.3图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数(AI)。　　2.4统计方法所有数据用SPSS11.5软件处理。数据以±ｓ表示。多组间比较用方差分析,两两比较用ｑ检验,率检验用χ2分析

6、。　　3.2桂枝对心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响空白对照组MRL小鼠凋亡指数和M-Caspase3基因表达较高，与之相比，桂枝组和强的松组的心肌细胞凋亡指数和Caspase3基因表达明显降低，（Ｐ<0.01），差异有显著性。桂枝组和强的松组相比无显著性差异（Ｐ>0.05）。见表2。表2各组小鼠心肌细胞凋亡及Caspase3mRNA基因表达的比较(略)　　4讨论狼疮性心脏病变是系统性红斑狼疮（SLE）常累及的器官病变之一，约30%的SLE患者有心血管表现，约10%的患者有心肌损害，严重者可发生心力衰竭导致死亡［1］。有研究表明SLE心肌损害与细胞凋亡有密切

7、关系［2］。本研究发现MRL小鼠心室肌细胞凋亡明显增加，凋亡指数增高，同时Caspase3mRNA基因表达明显增高，说明MRL小鼠心肌细胞凋亡和Caspase3mRNA基因表达存在必然联系，本课题通过观察空白组及治疗组心肌细胞凋亡和Caspase3mRNA基因表达的变化，力求探讨桂枝对于MRL小鼠心肌细胞的作用及机理。促凋亡因子Caspase3是半胧氨酸蛋白酶家族中最重要的成员之一，以无活性的酶原形式存在于细胞浆中，在凋亡信号的刺激下经蛋白酶水解作用切去原结构域，形成四聚体而活化，活化的Caspase3参与了一系列与凋亡有关的细胞变化过程，包括细胞内