caspase8、3蛋白在puva诱导k562细胞凋亡时的变化

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1、Caspase8、3蛋白在PUVA诱导K562细胞凋亡时的变化【摘要】目的研究Caspase8、3蛋白在补骨脂素（PSO）加长波紫外线（UVA）光化学疗法（PUVA）诱导人白血病K562细胞凋亡时的变化。方法用不同浓度的中药补骨脂中提取的PSO和（或）不同照射时间、波长为360nm的UVA作用于K562细胞，检测细胞凋亡率、在电镜下细胞超微结构改变及Caspase8、3蛋白的表达，用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析。结果PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加，后两者上调Caspase

2、8、3蛋白的表达，PUVA的作用显著强于前两者；PUVA处理后的K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变。结论PUVA可通过激活Caspase8、3基因诱导K562细胞凋亡。【关键词】光化学疗法K562细胞凋亡Caspase8Caspase3　　Abstract：ObjectiveTostudythechangesofCaspase8andCaspase3protEinsinK562cellsduringapoptosisinducedbypsoralen(PSO)plusultraviol

3、etA(UVA)(PUVA).MethodsTheK562cellsChinesemedicinepsoraleafruitsindifferentconcentrationsplusUVA(360nm)indifferentirradiationtimeornot.Apoptosisratios,ultrastructurechangesandexpressionofCaspase8andCaspase3protEInsongthefactors.ResultsPSO,UVAandPUVAal

4、lincreasedtheapoptosisratiosandUVAandPUVAupregulatedtheexpressionofCaspase8andCaspase3proteins,buttheeffectsofPUVAentotherapy;K562cell;apoptosis;Caspase8;Caspase3　　化疗药物杀伤白血病细胞的主要途径是诱导细胞的凋亡，Caspases(Cysteinylasparatespecificproteinase)是一种特异性蛋白酶，以执行

5、细胞凋亡而受到广泛关注［1~2］。Caspase8和Caspase3均属于该家族的成员，在凋亡过程中发挥重要作用，其中前者被认为是凋亡的启动者，后者被认为是凋亡的执行者［3］。PUVA是补骨脂素(psoralen，PSO)加长波紫外线（UltravioletA，UVA）光化学疗法，目前的研究对象多为人工合成PSO衍生物，我们从中药补骨脂中提取了PSO，研究PUVA在诱导人类白血病细胞K562凋亡时Caspase8、Caspase3蛋白的变化，以进一步了解PUVA诱导白血病细胞凋亡的作用机制。　　1材

6、料与方法　　1.1细胞株人慢性粒细胞白血病K562细胞由大连医科大学惠赠。常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025U/ml）中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。　　1.2药品及主要试剂　　补骨脂素由大连理工大学及我院共同由纯中药补骨脂中提取和制备。RPMI1640培养液为Gibco产品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品。HistostainTMPlUsKits免疫细胞化学分析试剂盒购自美国Zymed公司。DAB(3，3’diamino

7、benzidinetetrahydrochloride)显色试剂盒购自美国VectorLtd公司。Caspase8、Caspase3兔抗人多克隆抗体购自CellScience公司。　　1.3仪器和设备　　流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制。　　1.4流式细胞术测定　　PUVA后24hK562细胞的凋亡情况取浓度为4.0×105/ml，处于对数生长期的K562细胞5ml，分别加入补骨脂素0，5，10，20，40μl，使其在反应体系中的终浓度

8、分别为0，10，20，40，80mg/L，放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治疗仪（λ=360nm）上以1J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0min，5min。处理后各实验组细胞继续培养24h后，收集5.0×105细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100μl碘化丙啶（PI）染液，避光反应30min，加入PBS400μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。　　1.5透射电镜下观察细胞超微结构特点　　收集浓度为5.0