辛伐他汀诱导k562细胞凋亡过程中caspase3、caspase9活性变化

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1、辛伐他汀诱导K562细胞凋亡过程中Caspase3、Caspase9活性变化作者：黄文芳，杨永长,刘华，陈江，周定安【摘要】目的观察辛伐他汀诱导K562细胞凋亡过程中Caspase3、Caspase9活性的变化。方法不同浓度辛伐他汀处理K562细胞，用细胞形态学、流式细胞技术检测细胞凋亡，比色法测定Caspase3、Caspase9活性。结果5、10、20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48h后出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变,其凋亡率分别为（4.00±0.13）%、（6.2

2、4±0.18）%、（9.41±0.22）%，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。作用72h后细胞凋亡率分别为(7.62±0.21)%、(12.41±0.32)%、(19.08±0.26)%，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。同时Caspase3、Caspase9活性明显升高，10μmol/L与20μmol/L组Caspase3、Caspase9活性与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结论辛伐他汀可能通过活化Caspase9，并进而活化

3、Caspase3诱导K562细胞凋亡。【关键词】辛伐他汀；Caspase；细胞凋亡Keyvastatin;Caspase;Apoptosis0引言凋亡受阻是恶性肿瘤细胞的显著特征，寻找有效途径诱导肿瘤细胞凋亡是当今医学界研究的热点之一。他汀类(statins)药物是内源性胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCoA）还原酶竞争抑制剂，能抑制甲羟戊酸途径，影响胞内信号转导。近年研究表明，他汀类药物能诱导间皮瘤[1]、神经胶质瘤[2]、急性髓样白血病[3]和黑色素瘤[4]等多种肿瘤细胞

4、凋亡，且对正常细胞无明显的毒副作用，但其凋亡的机制尚不完全明确。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（CystEinylaspartatespecificprotease,Caspase）与细胞凋亡密切相关，研究表明他汀类药物诱导黑色素瘤和人横纹肌肉瘤细胞凋亡过程中均有Caspase的活化[4，5]。目前有关辛伐他汀诱导人红白血病K562细胞凋亡过程中是否有Caspase的活化未见报道，本研究采用分光光度法测定Caspase3、9活性，观察其在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的变化。1材料与方法1.1细胞

5、株人红白血病K562细胞株购自四川大学华西校区基础与法医学院免疫室。1.2主要试剂辛伐他汀由中国药品生物制品检定所提供。无水乙醇溶解后加入与辛伐他汀等物质的量浓度的NaOH，50℃水浴2h，调pH至7.20，过滤除菌，浓度为10mmol/L，分装后于-20℃保存备用，使用前用RPMI1640稀释后加入培养体系。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司产品,小牛血清购自美国GM公司产品,AnnexinⅤFITC试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司,Caspase3、Caspase9分光光度试剂

6、盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。1.3细胞培养K562用含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI1640培养基，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养，每2～3天换液传代培养。1.4细胞形态观察取对数生长期细胞，将不同浓度辛伐他汀加入培养体系，培养48h后收集细胞涂片，瑞氏染色后光镜观察细胞形态。1.5AnnexinⅤFITC检测细胞凋亡收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，实验组加入辛伐他汀，其终浓度分别为5、10、20μmol/L，每个

7、浓度均行3个复孔，同时设阴性对照组，相同条件下培养48、72h。收集各组细胞，4℃预冷的PBS洗细胞两次，结合缓冲液重新悬浮细胞，调节细胞浓度为1×106个/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μlAnnexinⅤFITC和10μl碘化丙锭溶液，混匀后室温避光孵育15min，反应管中加400μlPBS，流式细胞仪检测。1.6Caspase3、Caspase9活性测定收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，实验组加入辛伐他汀，其终浓度分别为5，10、20μmol/L

8、，每个浓度均行3个复孔，同时设阴性对照，相同条件下培养48h、72h。收集各组细胞，PBS洗涤2次，2000r/min离心5min，收集3～5×106细胞，用60μl冰冷LysisBuffer悬浮细胞，-20℃放置20min，4℃10000r/min离心3min，测定细胞裂解液上清蛋白浓度，并调整蛋白浓度为1.8μg/μl。每孔吸取50μl含90μg蛋白的细胞裂解上清，同时取50μlLysisBuffer作空白对照。每50μl2×ReactionBuffer加入0.5