应用dna微阵列研究斑蝥酸钠诱导k562细胞凋亡前后的基因变化

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1、2005年中国肿瘤临床年鉴应用DNA微阵列研究斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后的基因变化宋艳斌马文丽冯春琼郑文岭南方医科大学基因工程研究所广州510515斑蝥是芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥全虫。我国很早就有关于斑蝥能抗肿瘤的记载[1］。现代医学研究证明，斑蝥其有效成分是斑蝥素，即斑蝥酸酐，它是斑蝥体内提取的一种单萜类物质，可以抑制癌细胞的核酸代谢及蛋白质的合成，导致癌细胞死亡。但斑蝥素的不良反应较大，主要是泌尿道和消化道反应，使它的临床应用受到极大的限制。近来，人们合成了许多斑蝥素的衍生物，如斑蝥素与铂的络合物、去甲斑蝥

2、素、斑蝥酸钠等［2］，以降低斑蝥素的不良反应，增强药物疗效。我们应用DNA微阵列技术，观察了斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后细胞基因表达的改变，初步研究斑蝥钠诱导细胞凋亡的分子机制。　一、材料和方法（一）材料RPMI1640细胞培养基、SuperScriptⅡ反转录酶购自GibcoRBL公司，小牛血清购于四季青公司，噻唑蓝（MTT）购于Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购于上海生物工程公司，Trizol、DNA聚合酶（Taq酶）购于上海博彩生物工程公司，其它常用酶类购于宝生物工程公司。2×预杂交溶液:25%甲酰胺，5×SSC，

3、0.1%SDS;清洗溶液Ⅰ:2×SSC，0.1%SDS;溶液Ⅱ:0.1×SSC，0.1%SDS;溶液Ⅲ:0.1×SSC。Pixsys5500芯片打印仪购自Cartesian公司，ScanArrayLite芯片扫描仪及其分析软件Quantarray购自GsiLumonics公司，玻片及芯片杂交盒购自Corning公司。艾易舒注射液（0.1mg/10ml即斑蝥酸钠维生素B6注射液），贵州柏强制药有限公司提供，批号20030717。　　（二）方法1.药物作用浓度的确定依据静脉滴注药物的血浆峰值浓度公式：C=50×D/5000×2（μg/

4、ml）D指每日的给药量（mg/d）以及艾易舒注射液在临床的使用药量（0.5mg/d），计算出艾易舒注射液的血峰浓度为2.5μg/ml。艾易舒注射液处理的实验组依预实验结果，设立1.25μg/ml;2.5μg/ml和5.0μg/ml三个浓度。　2.细胞培养及处理人红白血病细胞K562培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中，常规培养。每3日换液1次。实验时，以1×104个细胞/ml接种，在细胞的对数生长期加入药物，使其浓度分别为:处理组（艾易舒注射液）1.25μg/ml、2.5μg/ml、

5、5.0μg/ml;阴性对照（生理盐水）0μg/ml。　3.艾易舒注射液对K562细胞生长的抑制作用K562细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1ml。细胞处理同前所述。培养20h后，加入MTT溶液，继续培养4h，参照文献［3］的方法，在570nm波长处测定A值。每个浓度接种3个孔，绘制细胞增殖抑制曲线。　　4.细胞凋亡的检测细胞接种于24孔细胞培养板中，如上法加入药物，常规培养后，加入MTT溶液，镜下观察细胞的凋亡情况［4］。同时细胞接种在250ml细胞培养瓶中，培养24h后，提取细胞的DNA［5］，1.0%的琼脂糖凝胶电泳，恒

6、压30V/cm。5．样品制备K562细胞培养基中加入艾易舒注射液，继续培养4h后，离心收获细胞，参照Trizol试剂盒的方法，提取细胞总RNA。取总RNA40μg，用SuperScriptⅡ反转录成cDNA第一链，分别用Cy3/Cy5标记对照组/处理组，PCR产物纯化试剂盒纯化后溶于30μlTE中。真空抽干，重溶于5μl水中。分别取出2μl，加入2×杂交缓冲液2μl，95℃5min，14000r/min，离心2min，取出3.5μl用于与微阵列杂交。　　6.DNA微阵列探针的收集及芯片制备常规培养的K562细胞，提取细胞的总RNA

7、，合成cDNA第一链后，用RD技术［3］收集cDNA片段，与T载体连接后转入质粒中保种。PCR扩增插入片段，异丙醇纯化后，调整浓度为600ng/μl，打印芯片。共收集了162个cDNA探针片段，以看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为阳性对照，水稻基因组DNA为阴性对照，50%二甲基亚砜（DMSO）为空白对照，每个探针重复打印3个点，形成30×18的阵列。打印好的芯片经紫外交联（能量为90mJ），80℃干烤2h，避光保存备用。　7.DNA微阵列的杂交检测及数据处理DNA微阵列在42℃杂交18h，取出，分别用清洗溶液Ⅰ、Ⅱ、

8、Ⅲ洗涤，空气干燥。扫描仪扫描每个探针的荧光强度，用ScanArray软件进行分析，根据以下两个条件作为判断基因差异表达的标准:（1）两者的荧光强度之比Cy5/Cy3>2或<0.5;（2）任一点的荧光强度值必须>500.0。　（二）结果1.艾易舒注射