kdrsirna对乳癌细胞凋亡和nes1与runx3基因甲基化影响

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1、KDRsiRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响：许秀娥徐宏伟葛银林张金玉冯翠萍【摘要】目的探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst33258染色观察MCF7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因

2、甲基化状态和mRNA的转录水平。结果靶向KDR的siRNA转染MCF7细胞后可诱导细胞凋亡，NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低，出现非甲基化条带，同时mRNA表达上调。结论KDRsiRNA在体外能逆转MCF7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化，并诱导细胞凋亡。【关键词】RNA干扰;MCF7细胞;血管内皮生长因子受体2;甲基化;细胞凋亡[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatethefeasibilityandspecificityofgenetherapyforbreastcancerbyusin

3、gKDRgeneexpressionthroughchemicallymodifiedsiRNAinvitro.MethodsThesiRNAeLipofectamine2000TMtoknockdoeasuredbyHoechst33258staining;methylationspecificPCR(MSP)assayethylationstatusofNES1andRUNX3gene;theexpressionsofmRNAofNES1andRUNX3geneerasechainreaction(RTPCR).Resultss

4、iRNAdirectedagainstKDRinducedtheapoptosisofMCF7,loethylation,theunmethylationappeared,and,meanRNA.ConclusionKDRsiRNAcan,invitro,reversethemethylationofNES1andRUNX3,andinduceapoptosis.　　[KEYCF7cells;vascularendothelialgroethylation;apoptosis　　恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内血管的再生是肿瘤组织内细

5、胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础。有研究认为，含激酶插入区受体(KDR)，即血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是血管内皮生长因子(VEGF)发挥功能的主要受体，其不仅分布于组织的血管内皮细胞，也分布于部分肿瘤细胞(MCF7细胞、HL60细胞等)，对于肿瘤增殖与新血管形成起重要作用[1]。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象，它通过降解具有同源序列的mRNA而起作用，特殊设计的小干扰RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默[2]。前期研究显示，KDRsiRNA转染乳癌细胞株MCF7后可抑制细胞增

6、殖。本研究旨在进一步探讨其对MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响，为其应用于临床提供理论和实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞株人乳癌细胞株MCF7购自中国协和医科大学基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM(GIBCO公司产品)培养液中，置于含体积分数0.05的CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养传代。　　1.1.2主要试剂DMEM培养基、Lipofectamine2000TM及TrizolReagent由Invitrogen公司生产;AMV逆转录试剂盒由Bioer公司提供;

7、细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(c0003)为Beyotime公司产品;基因组DNA修饰试剂盒由Zymo公司提供。　　1.2siRNA设计合成　　根据文献[3]确定KDRsiRNA序列,其正义链为5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′，反义链为5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′;阴性对照siRNASCR序列正义链为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反义链为5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′。两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同源性。为

8、增强siRNA的稳定性，对正义链进行甲基化修饰，反义链不修饰，并由上海吉玛制药技术有限公司合成。　　1.3转染　　根据Lipofectamine2000TM试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴