runx3基因甲基化与胃癌发生和转移的关系

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1、Runx3基因甲基化与胃癌发生和转移的关系作者：李华李勇范立侨赵雪峰宋振川赵群王力利焦志凯刘羽　【摘要】目的探讨Runx3基因启动子甲基化与胃癌发生发展过程的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测80例胃癌组织及肿瘤周围粘膜组织中Runx3mRNA的表达,同时用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测Runx3基因启动子甲基化情况。结果80例胃癌组织标本中Runx3基因的表达（0.5971±0.1013）较肿瘤周围组织中表达明显下调（0.8297±0.2912）,差异有统计学意义(P<0.05)。正常粘膜组织中未发现有R

2、unx3基因启动子的甲基化,80例胃癌组织中有43例检测到Runx3基因启动子的甲基化,胃癌组织Runx3基因启动子甲基化率显著增高(P<0.05)。胃癌标本中Runx3mRNA的表达与其病理临床特征密切相关，在低分化和有淋巴结转移胃癌组织标本中Runx3mRNA的表达显著下调(P<0.05)。结论Runx3基因启动子甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一并且与胃癌的发生、发展密切相关。【关键词】胃癌；Runx3基因；RTPCR；DNA甲基化1资料与方法1.1资料1.1.1标本80例胃癌组织标本取自我院2005年1月~

3、8月的手术切除标本，立即放液氮中速冻，-80℃冻存备用。同时选取癌旁5cm组织作为对照。年龄28~80岁，中位年龄57岁,男45例,女35例,有淋巴结转移45例。所有标本术后均经病理证实。1.1.2试剂Trizol购自Invitrogen公司。cDNA第一链反应试剂盒购自Fermentas公司。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成。DNA纯化试剂盒购自Promega公司,氢酯和亚硫酸氢钠购自SIGMA公司。1.2方法1.2.1组织总RNA提取将组织标本研磨后，采用Trizol试剂按照说明书提取组织样本总RNA，备用。1.2.2逆转录

4、多聚合酶链反应（RTPCR）紫外分光光度计定量总RNA,调整浓度为1μｇ/μｌ。按cDNA第一链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。用GAPDH做为内参照进行PCR。Runx3的引物序列：上游：5'GATGGCAGGCAATGACGA3'，下游：5'TGCTGAAGTGGCTTGTGGT3',扩增长度：353bp。GAPDH的引物序列：上游：5'AACGGATTTGGTCGTATTG3',下游：5'GGAAGATGGTGATGGGATT3'，扩增长度：208bp。PCR参数:94℃5min变性;94℃45s,55

5、℃55s,71℃45s,32个循环;72℃延伸7min。PCR产物于2%琼脂糖电泳，电压60V，55min。GelID凝胶图像分析系统摄片分析测定其光密度。计算各个样本Runx3积分光密度（条带强度×条带面积)与GAPDH内对照积分光密度的比值,反映Runx3mRNA表达的变化。1.2.3DNA提取、纯化和亚硫酸盐修饰称取150mg标本在未解冻时迅速用眼科剪剪碎,然后按DNA纯化试剂盒说明书提取DNA。取1μgDNA加入50μｌ总体积中,加2mol/LNaOH使其终浓度为0.2mol/L,37℃变性处理10min。再加入新鲜配制10mmo

6、l/L氢酯20μｌ,520μｌ的亚硫酸氢钠,置于50℃水浴16h,修饰后的DNA用ethylation2specificPCR,MSP)甲基化特异性引物上游引物序列为5'TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG3',下游引物为5'AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC3',扩增片段为210bp。非甲基化特异性引物上游序列为5'TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG3',下游引物为5'AAAACAACCAACACAAACAACTCC3',扩增片段为210bp,反应体系总体积为25μｌ,甲基化反应条

7、件为94℃5min预变性，94℃30s,65.6℃45s,72℃55s,共35个循环,72℃延伸5min。非甲基化反应条件为94℃5min预变性，94℃30s,61.2℃45s,72℃55s,共35个循环,72℃延伸5min。PCR产物5μｌ于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外线下观察拍照分析。1.3统计学处理数据用±s表示,采用SPSS10.0统计软件行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Runx3mRNA在胃癌和癌旁组织中的表达Runx3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后，电泳结果显示扩增片段大小分别为

8、353bp和208bp。Runx3表达量相对值在胃癌及癌旁组织中的表达，见表1。表1Runx3基因mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达组织来源表达相对值（±s）tP胃癌组织0.5971±0.101