kdr sirna对乳癌细胞凋亡和nes1与runx3基因甲基化影响论文

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1、KDRsiRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响论文许秀娥徐宏伟葛银林张金玉冯翠萍【摘要】目的探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst33258染色观察MCF7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平。结果靶向KD

2、R的siRNA转染MCF7细胞后可诱导细胞凋亡，NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低，出现非甲基化条带，同时mRNA表达上调。结论KDRsiRNA在体外能逆转MCF7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化，并诱导细胞凋亡。【关键词】RNA干扰;MCF7细胞;血管内皮生长因子受体2;甲基化;细胞凋亡ABSTRACTObjectiveToinvestigatethefeasibilityandspecificityofgenetherapyforbreastcancerbyusingKDRgeneexpressionthroughchemicallymodifiedsiRN

3、Ainvitro.MethodsThesiRNAeLipofectamine2000TMtoknockdoeasuredbyHoechst33258staining;methylationspecificPCR(MSP)assayethylationstatusofNES1andRUNX3gene;theexpressionsofmRNAofNES1andRUNX3geneerasechainreaction(RTPCR).ResultssiRNAdirectedagainstKDRinducedtheapoptosisofMCF7,loethylation,theunmet

4、hylationappeared,and,meanRNA.ConclusionKDRsiRNAcan,invitro,reversethemethylationofNES1andRUNX3,andinduceapoptosis.KEYCF7cells;vascularendothelialgroethylation;apoptosis恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内血管的再生是肿瘤组织内细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础。有研究认为，含激酶插入区受体(KDR)，即血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是血管内皮生长因子(VEGF)发挥功能的主要受体.freelRNA而起作用，特殊

5、设计的小干扰RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默2。前期研究显示，KDRsiRNA转染乳癌细胞株MCF7后可抑制细胞增殖。本研究旨在进一步探讨其对MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响，为其应用于临床提供理论和实验依据。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株人乳癌细胞株MCF7购自中国协和医科大学基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM(GIBCO公司产品)培养液中，置于含体积分数0.05的CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养传代。1.1.2主要试剂DMEM培养基、Lipofectamine2000TM及TrizolReagent由In

6、vitrogen公司生产;AMV逆转录试剂盒由Bioer公司提供;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(c0003)为Beyotime公司产品;基因组DNA修饰试剂盒由Zymo公司提供。1.2siRNA设计合成根据文献3确定KDRsiRNA序列,其正义链为5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′，反义链为5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′;阴性对照siRNASCR序列正义链为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反义链为5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′。两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同

7、源性。为增强siRNA的稳定性，对正义链进行甲基化修饰，反义链不修饰，并由上海吉玛制药技术有限公司合成。1.3转染根据Lipofectamine2000TM试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的细胞,调整细胞密度，接种于12孔板，用含体积分数0.10血清、不含抗生素的DMEM培养，次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。siRNA与Lipofectamine2000TM分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释,5m