医学毕业论文kdrsirna对乳癌细胞凋亡和nes1与runx3基因甲基化影响

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1、乳癌细胞凋亡租胃基M甲基化影姓名：2014年6月25日KDRsiRNA对乳癌细胞凋亡和NESI与RUNX3基因甲基化影响作者：许秀娥徐宏伟葛银林张金玉冯翠萍【摘要】目的探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法采用阳离子脂质体Lipofcctaminc2000TM作为转染试剂，将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst33258染色观察MCF7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基

2、化状态和mRNA的转录水平。结果靶向KDR的siRNA转染MCF7细胞后可诱导细胞凋亡，NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低，出现非甲基化条带，同时mRNA表达上调。结论KDRsiRNA在体外能逆转MCF7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化，并诱导细胞凋亡。【关键词】RNA干扰;MCF7细胞;血管内皮生长因子受体2;甲基化;细胞凋亡[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatethefeasibilityandspecificityofgenetherapyforbreastcancerbyusingKDRgeneexpressionthroughchemical

3、lymodifiedsiRNAinvitro.MethodsThesiRNAwastransfectedintoMCF7cellsbyusingcationicliposomeLipofectamine2000TMtoknockdownKDRgene.ApoptosiswasmeasuredbyHoechst33258staining;methylationspecificPCR(MSP)assaywasusedtoanalyzethemethylationstatusofNESIandRUNX3gene;theexpressionsofmRNAofNESIandRUNX3genewerede

4、tectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR).ResultssiRNAdirectedagainstKDRinducedtheapoptosisofMCF7,loweredthedegreeofNESIandRUNX3methylation，theunmethylationappeared，and，meanwhile，upregulatedtheexpressionsofmRNA.ConclusionKDRsiRNAcan,invitro,reversethemethylationofNESIandRUNX3,andind

5、uceapoptosis.［KEYWORDS］RNAinterference;MCF7cells;vascularendothelialgrowthfactorreceptor2;methylation;apoptosis恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内血管的再生是肿瘤组织内细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础。有研究认为，含激酶插入区受体(KDR),即血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是血管内皮生长因子(VEGF)发挥功能的主要受体，其不仅分布于组织的血管内皮细胞，也分布于部分肿瘤细胞(MCF7细胞、HL60细胞等)，对于肿瘤增殖与新血管形成起重要作用［1］。RNA干扰(RNAi)是由双链

6、RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象，它通过降解具有同源序列的mRNA而起作用，特殊设计的小干扰RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默［2］。前期研究显示，KDRsiRNA转染乳癌细胞株MCF7后可抑制细胞增殖。本研宂R在进一步探讨其对MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响，为其应用于临床提供理论和实验依据。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株人乳癌细胞株MCF7购自中国协和医科大学基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM(GIBCO公司产品)培养液中，置于含体积分数0.05的CO2、37°C饱和湿度的孵箱中培养传代。1.1.2主要试剂DMEM培养

7、基、Lipofectamine2000TM及TrizolReagent由Invitrogen公司牛.产;AMV逆转录试剂盒由Bioer公司提供;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒（cOOO3）为Beyotime公司产品;基因组DNA修饰试剂盒由Zymo公司提供。1.2siRNA设计合成根据文献［3］确定KDRsiRNA序列，其正义链为5'GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3',反义链为5'U