去甲基化制剂对肝癌细胞smmc-7721生长及runx3基因表达的影响

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1、郑州大学硕士学位论文去甲基化制剂对肝癌细胞SMMC--7721生长及RUNX3基因表达的影响姓名：何艳新申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：刘超201204中文摘要去甲基化制剂对肝癌细胞SMMC．7721生长及RUNX3基因表达的影响硕士研究生：何艳新导师：刘超郑州大学第二附属医院普外科河南郑州450002研究背景肝细胞癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，是原发性肝癌的主要类型之一。然而其发病机制尚未完全阐明，肝癌的发生发展是一个涉及多基因的变化、多因素、多步骤的连续过程。近年来研究发现，表观遗传学的改变在肝癌的发生、发展过

2、程中扮演着重要的角色。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化(DNArnethylation)，基因组印记(genomicimpriting)，母体效应(maternaleffects)，基因沉默(genesilencing)，核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑(RNAediting)等。其中抑癌基因RUNX3启动子区域的CpG岛被甲基化，导致该基因的表达沉默，成为近些年来研究肝癌相关发生发展机制及治疗的热点之一。研究报道，肝癌细胞中抑癌基因RUNT相关转录因子3(Runt．relatedtranscriptionfa

3、ctor3，RUNX3)由于CpG岛启动子高甲基化，其在mRNA水平及蛋白水平表达明显下调。5．氮杂．2’．脱氧胞嘧啶核苷(5．Aza-2’．deoxycytidine，5-Aza．de)是一种核苷酸类甲基转移酶抑制剂，也可以对DNA甲基转移酶进行特异性抑制，使DNA甲基化程度下降，进而逆转因甲基化而沉默的基因重新开始表达。在肝癌组织中RUNX3基因CpG岛甲基化的相关研究已有不少报道，而5-Aza．dC在肝癌细胞系SMMC一7721中对该基因甲基化状态影响的研究尚不多见。中文摘要目的探讨去甲基化制剂5-Aza-dC对肝癌

4、细胞株SMMC一7721抑癌基因RUNX3甲基化状态、mRNA表达水平及肝癌细胞生长周期的影响。材料与方法肝癌细胞SMMC．7721由河南省肿瘤医院中心实验室所赠，选择在RPMI．1640培养液(10％胎牛血清、100U／ml青霉素、100megm1)中培养，培养液置于37"(2，饱和湿度的细胞培养箱中。每2到3天换液传代1次。并分为对照组(不进行加药处理)和5-Aza-dC处理组。1不同浓度的5-Aza．dC对肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基因启动子区域甲基化状态的影响：分别以0．5pmol／L、1．5“mol／L

5、、4．5rtmol／L、13．51上mol／L浓度的5-Aza—dC培养肝癌细胞SMMC．772172h，提取细胞DNA，参照甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation-specificpolymerasechainreaction，MSP)技术，分别设计甲基化和非甲基化引物，检测两组肝癌细胞RUNX3基因启动子区域的甲基化状态。2不同浓度的5．Aza-dC对肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基因mRNA的作用：分别以O．51上mol／L、1．5I，trnol／L、4．5pmol／L、13．5“moFL浓度的5-

6、Aza-dC培养肝癌细胞SMMC．772172h，提取细胞RNA，应用RT-PCR(Real—timePCR)技术检测两组肝癌细胞SMMC．7721中RUNX3mRNA表达的影响。3不同浓度的5-Aza-dC对肝癌细胞SMMC．7721细胞周期的影响：分别以0．5／amol／L、1．5pmol／L、4．5pmol／L、13．5pmol／L浓度的5-Aza—dC培养肝癌细胞SMMC．772172h，收集细胞，使用流式细胞术(FCM)检测两组肝癌细胞SMMC．7721细胞周期的影响。4统计学处理：采用SPSSl8．0统计软件对

7、数据进行分析，结果以均数士标准差(孑士s)表示，以p<0．05为差异有统计学意义。结果1不同浓度的5-Aza．dC对肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基因启动子区域甲基化状态的影响：MSP结果显示，对照组肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基因启动子区域存在高甲基化。在分别以0．51上mol／L、1．5p．mol／L、4．5p,mol／L、13．5“mol／L浓度的5-Aza-dC培养肝癌细胞SMMC．772172h后，肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基II中文摘要因启动子区域甲基化状态随药物浓度增加而出现不同程度的

8、逆转，逆转程度呈现出药物浓度依赖性的趋势；25-Aza-dC对肝癌细胞SMMC．7721RUNX3基因mRNA的影响：RT-PCR检测结果发现，对照组肝癌细胞SMMC．7721RUNX3mRNA未能检测到表达，经过0．5／zmollL、1．5pmol／L、4．59mol／L、13．5J．tmol／L浓度