sirna沉默pc3细胞中kdr基因的的论文

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1、siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的的论文【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体ⅱ（kdr）基因的shrna表达载体，研究kdr基因沉默后对pc3细胞的增殖、生长的影响.方法：将合成的三对dna正义链及反义链变性、退火，形成的双链dna与psilencertm3.1h1neo线性质粒用t4dna连接酶连接，构建psilencer3.1kdr1,psilencer3.1kdr2和psilencer3.1kdr3三个sirna表达载体.经酶切及dna测序鉴定后，采用脂质体介导的基因法转染pc3细

2、胞，通过rtpcr、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测kdr的表达变化,mtt法检测细胞生长速度的变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化，以未转染和转染阴性对照质粒psilencer3.1nc的pc3细胞为对照.结果：酶切及测序证实设计合成的dna已正确插入载体.rtpcr、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，psilencer3.1kdr3有效地降解了pc3细胞中kdr基因的mrna，下调蛋白表达;转染psilencer3.1kdr3后pc3细胞生长速度明显变慢.结果表明,psilencer3.

3、1kdr3组pc3细胞的g0/g1期百分率明显增高，而s期和g2m期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(p<0.01).而psilencer3.1kdr1和psilencer3.1kdr2无效.结论：成功构建针对kdr基因的sirna表达载体，只有psilencer3.1kdr3可有效地沉默kdr在前列腺癌细胞系pc3细胞中的表达，抑制pc3细胞的增殖.【关键词】rna,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;pc3细胞;前列腺肿瘤0引言血管内皮生长因子受体ⅱ，又称激酶功能区受体(vasc

4、ularendothelialgroainreceptor,kdr)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于vegf的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有vegf和kdr表达，存在vegfkdr自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.我们用psilencertm3.1h1neo在前列腺癌细胞系pc3内表达针对kdr基因的短发卡状rna(shorthairpinsmallinterferingrna,shrna),阻断

5、或降低细胞中kdr基因的表达，探讨kdr基因沉默后对pc3细胞增殖、生长的影响.1材料和方法1.1材料psilencertm3.1h1neo质粒(美国ambion公司)；lipofectamim2000转染试剂(美国invitrogen公司)；pc3细胞株为本室保存；鼠抗人kdrmab,羊抗鼠二抗,dab显色液(武汉博士德公司)；gapdh内参及其mab(上海康成生物有限公司)；pegfpn2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.1.2方法1.2.1sirna靶序列的设计及其表达载体构建根据s

6、irna设计原则［3］以及kdr(基因号af063658)选取并针对kdr基因编码区（a：395～414aacatggagtcgtgtacatta；b：2969～2988aagctcctgaagatctgtata；c：3906～3925aagcggctaccagtccggata），分别命名为（psilencer3.1kdr1,psilencer3.1kdr2,psilencer3.1kdr3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成.按操作说明将合成的dna变性、退火，形成的双链dna与psilen

7、certm3.1h1neo线性质粒连接，转化dh5α感受态细胞，lb平板（amp+）筛选阳性克隆，提取质粒进行bamhⅰ,hindⅲ双酶切及琼脂糖电泳鉴定，并提交大连宝生生物公司进行测序.1.2.2sirna表达质粒转染pc3细胞提取测序正确的sirna表达载体和pegfpn2质粒并测定浓度.将pc3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，sirna表达载体转染pc3细胞按操作说明进行，每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μl.以任何已知序列不同源的shrna序列的质粒为阴性对照,以带有绿色荧光蛋白

8、的pegfpn2质粒同步转染，荧光倒置显微镜于395nm检测转染效率.1.2.3rtpcr检测kdr的表达转染后48h，提取总rna并定量，用dna酶ι处理总rna以去除dna污染，取等量的rna反转录后进行pcr.psilencer3.1kdr1位点pcr引物正义链：5′gcccaataatcagagtggcagtg3′，反义链：5′gagacggactcagaaccacatca3′，产物长度506bp；psil