siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达.doc

《siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达作者：缪应业，刘新，李浩，乔卿华，侯林虎，刘小圆，郝晓柯【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）基因的shRNA表达载体，研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响.方法：将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1neo线性质粒用T4DNA连接酶连接，构建pSilencer3.1KDR1,pSilencer3.1KDR2和Psilencer3.1KDR3三个siRNA表达载体.经酶切及DNA测序鉴定后，采用

2、脂质体介导的基因法转染PC3细胞，通过RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化，以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1NC的PC3细胞为对照.结果：酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，pSilencer3.1KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA，下调蛋白表达;转染pSilencer3.1KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢.结果表明,pSilence

3、r3.1KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高，而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01).而pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2无效.结论：成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体，只有pSilencer3.1KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达，抑制PC3细胞的增殖.【关键词】RNA,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;PC3细胞;前列腺肿瘤0引言血管内皮生长因子受体Ⅱ，又称激酶功能区受体(vascularendot

4、helialgrowthfactorⅡ,VEGFR2/kinasedomainreceptor,KDR)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.我们用pSilencerTM3.1H1neo在前列腺癌细胞系PC3内表达针对KDR基因的短发卡状RNA(shorthairpinsmallinterferingRNA,shR

5、NA),阻断或降低细胞中KDR基因的表达，探讨KDR基因沉默后对PC3细胞增殖、生长的影响.1材料和方法1.1材料pSilencerTM3.1H1neo质粒(美国Ambion公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；PC3细胞株为本室保存；鼠抗人KDRmAb,羊抗鼠二抗,DAB显色液(武汉博士德公司)；GAPDH内参及其mAb(上海康成生物有限公司)；pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.1.2方法51.2.1siRNA靶序列的设计及其表达载体构建根据siR

6、NA设计原则［3］以及KDR(基因号AF063658)选取并针对KDR基因编码区（A：395～414AACATGGAGTCGTGTACATTA；B：2969～2988AAGCTCCTGAAGATCTGTATA；C：3906～3925AAGCGGCTACCAGTCCGGATA），分别命名为（pSilencer3.1KDR1,pSilencer3.1KDR2,pSilencer3.1KDR3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成.按操作说明将合成的DNA变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1neo

7、线性质粒连接，转化DH5α感受态细胞，LB平板（AMP+）筛选阳性克隆，提取质粒进行BamHⅠ,HindⅢ双酶切及琼脂糖电泳鉴定，并提交大连宝生生物公司进行测序.1.2.2siRNA表达质粒转染PC3细胞提取测序正确的siRNA表达载体和pEGFPN2质粒并测定浓度.将PC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，siRNA表达载体转染PC3细胞按操作说明进行，每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μL.以任何已知序列不同源的shRNA序列的质粒为阴性对照,以带有绿色荧光蛋白的pEGFPN2质粒同步转染，荧光倒置显微镜于395

8、nm检测转染效率.1.2.3RTPCR检测KDR的表达转染后48h，提取总RNA并定量，用DNA酶Ι处理总RNA以去除DNA污染，取等量的RNA反转录后进行PCR.pSilencer3.1KDR1位点PCR引物正义链：5′GCCCAATAATCAGAGTG