利用原核表达外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

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1、利用原核表达外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清　　摘要：【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒（SMYEV）外壳蛋白（CP）为抗原制备抗血清的方法，从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEVCP重组蛋白在大肠杆菌中表达，分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后，分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测，同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEVCP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0ku左右的特异性重组蛋白谱带，以纯化的重组蛋白

2、为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清，该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测，2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEVCP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。关键词：草莓轻型黄边病毒（SMYEV）；CP；原核表达；抗血清；ELISA中图分类号：S668.4文献标志码：A文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0578-0410草莓轻型黄边病毒（Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV

3、）是一种严重危害草莓生产的病毒，通过蚜虫持久性传播，在世界上广泛分布[1]。SMYEV归属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），其病毒粒子为线形，基因组为1条单链RNA，全长约6000个核苷酸，包含5个开放阅读框（ORF）[2]。随着SMYEV在世界各地广泛传播，SMYEV生物学特性也不断变化，不同分离物在不同草莓病毒指示植物上症状表现多样，这为病毒鉴定、病害防治带来了困难[3]。病毒检测是病毒研究的一项重要内容，简单、快速、灵敏的病毒检测方法的建立对于病毒病的防治具有重要意义。早期检测SMYEV的方法为指示植物小叶嫁接法，其周期长，检测效率较低[1]。近年来，R

4、T-PCR成为SMYEV检测的主要方法[4-6]。利用RT-PCR检测病毒具有灵敏度高、周期短、试材用量少等优点，但是成本较高，而且对实验室条件和操作人员的素质要求也较高。基于抗血清的酶联免疫吸附分析（ELISA）是病毒检测中常用的方法之一，具有快速、成本低廉、灵敏度高等优点，可以大规模应用于植物病毒的检测[7]。应用ELISA技术检测病毒的前提条件是具有该病毒的抗血清。传统的病毒抗血清制备是以纯化病毒粒子为抗原，SMYEV在草莓植株内含量较低，病毒粒子的纯化很困难[8]。以原核表达病毒外壳蛋白（coatprotein，10CP）为基础的抗血清制备，克服了传统通过提纯

5、病毒粒子并以病毒粒子为抗原制备抗血清的种种弊端，并且能够大量获得特异性高的抗血清。这种技术已在柑橘速衰病毒（Citrustristezavirus）[9]、沙地葡萄茎痘伴随病毒（Rupestrisstempittingassociatedvirus）[10]、苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus）[11]、苹果茎痘病毒（Applestempittingvirus）[12]等果树病毒上获得成功。在克隆SMYEV分离物SY05的CP基因全长并实现在大肠杆菌中表达重组蛋白的基础上[13]，我们从大肠杆菌细胞中纯化SMYEVCP，并制备其抗

6、血清，比较分析抗血清检测病毒与RT-PCR检测病毒的一致性与灵敏性，为通过ELISA技术大规模检测SMYEV奠定基础。1材料和方法1.1材料用于SMYEV检测方法比较分析的草莓试材有26份，分为两类：一类是离体保存的试管苗，品种为‘布兰登堡’；另一类是草莓田间植株，包括25个品种。1.2SMYEVCP在原核细胞中诱导表达及电泳分析1.3抗血清制备从菌液中分离纯化重组蛋白，然后以重组蛋白为抗原对2只成年新西兰兔进行免疫。初次免疫时将重组蛋白1mL（1g·L-1）与弗氏完全佐剂1∶1混匀后，用510mL注射器进行背部多点注射。初次免疫后每2周加强免疫一次，加强免疫用同样量

7、重组蛋白与不完全弗氏佐剂1∶1混合后背部皮下多点注射。每次加强免疫后14～15d，从耳缘静脉取血液1mL，常规方法分离血清，用间接ELISA法测定血清效价。血清效价达到要求后，取血并按照常规方法分离纯化抗血清。1.4DAC-ELISA检测SMYEV1.5RT-PCR检测SMYEV2结果与分析2.1SMYEV原核表达产物的SDS-PAGE分析2.2SMYEV抗血清的制备2.3SMYEV抗血清在病毒检测时的应用效价2.4ELISA与RT-PCR检测SMYEV效果比较利用DAC-ELISA和RT-PCR分别对26份草莓材料进行SMYEV检测。DAC-ELI