烟草花叶病毒原核表达外壳蛋白抗体制备及快速检测方法建立-论文.pdf

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1、2014年27卷4期西南农业学报V0L27Nn4SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences1547文章编号：1001—4829(2014)04—1547一o4烟草花叶病毒原核表达外壳蛋白抗体制备及快速检测方法建立卢训，方琦，尹跃艳，秦西云，丁铭h(1．云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室，云南昆明650223；2．云南省烟草农业科学研究院，云南昆明650031)摘要：用RT．PCR从感染烟草花叶病毒(Tobacco

2、mom／ct，TMV)的烟草样品中克隆该病毒的外克蛋白基因，病毒外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，构建成重组原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，经IFrG诱导、Ni+NTA亲和柱纯化获重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔，制备TMV外壳蛋白多克隆抗体，并用制备的多克隆抗体建立了更简便、经济、特异性更强的DOT-EIJSA检测法。关键词：烟草花叶病毒；原核表达；多克隆抗体；DOT—ELISA中围分类号：s572文献标识码：APreparationofPolyclonalAntibodyandEstablish

3、mentofRapidDetectionMethodforTobaccoMosaicvirusLUXun，FANGQi，YINYue．yan，Q]NXi—yun2’，DINGMing’(I．InstituteofBiotechnologyandGermplasmResources，YunnanAcademyofAcl】1turaISciences，YunnanPIDvincoKeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology，KeyLaboftheSouthwesternCropGeneResources

4、andGermplasmInnovation，MinistryofAgriculture，YunnanKunming650223，China；2．YunnanA~cuhuralAcademyofTobaccoResearch，YunnanKunming650031，China)Abstract：ThefulllengthcDNAoftobaccomosaicvirus(TMV)whichencodedcoatproteinWesclonedfromthevirusinfectedtobacco8an1-piesbyRT·PCR，and

5、subclonedintoaprckaryoticexpressionvectorpET-30a(+)．Therecombinantprokaryoticexpressionvectorwasusedto仃jmmnEscher／~／aco／／BL21．WithinductionofIPTGandpurificationofNi+NTAafinityc~umnthepurifiedrecombinantproteinW88usedtoimmunizerabbitsforproductionofpolyclonalantibodiesag

6、ainBtthecoatproteinofTMV．UsingpolyclonalantibodiesandDOT—ELISAwmestablishedforreliable。sensitiveandspecificdetectionofTMV．Keywords：Tobaccomosaicvirus；Proka~oticexpresion；Polyclonalantibody；DOT-ELISA烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)是用无毒健苗是现阶段控制烟草普通花叶病的主要策烤烟漂浮育苗过程中主要危害的植物病毒病

7、原之略，但TMV病毒粒子较为稳定，具有较长的体外存一其具有“发生快、危害重、影响大”等的特点，已活时间，能在土壤、池水及漂盘中长期存活，成为下，成为阻碍烤烟工厂化集中育苗推广和应用的主要风一年度的初侵染源，对烟草漂浮育苗造成危害。险之一，随着该项技术的大面积推广应用，有效控制而在苗期快速、准确地开展TMV等病原的检测和预烟草普通花叶病在烤烟漂浮育苗阶段的发生危害显警是培育健壮苗的重要保障之一。为此本研究以得尤为重要⋯。现阶段对烟草病毒病的控制主要TMV作为材料，通过原核表达病毒外壳蛋白、免疫依靠抗病品种应用】、无毒健康种苗培育以及抗病

8、家兔制备TMV多抗血清，并建立了更简便、经济、特毒化合物预防等方法J，由于当前主栽品种抗耐异性更强的DOT—ELISA检测法。病性的缺陷和抗病毒制剂有限的防治效果，因此，使1材料与方法收稿日期：2013—02—181．1