齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用.pdf

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1、浙江大学学报(农业与生命科学版)36(4)：3754380，2010JournalofZhejiangUniversity(Agrie．＆．LifeSci．)文章编号：1008—9209(2010)04—037506DOI：10．3785／j．issn．1008—9209．2010．04．004齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用章颉，孟春梅，荣松，张超，洪健，吴建祥(1．浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，浙江杭州310029；2．浙江传化生物技术有限公司，浙江杭州311231)摘要：齿兰环斑病毒(Odontoglossumrings

2、potVIr~S，ORSV)是感染兰花的主要病毒之一．用RTPCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477bp外壳蛋白基因(CP)，外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET32a中构建重组原核表达载体pET一32aCP；将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，Ni”一NTA亲和柱纯化获得分子量约为37ku含硫氧还蛋白的融合蛋白．以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体，并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT—PCR及dotblotELISA方法，为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病

3、育种和脱毒苗的建立打下了基础．关键词：齿兰环斑病毒；原核表达；多克隆抗体；dotblotEIISA；免疫捕获RT—PCR中图分类号：Q78；S4324文献标志码：AZHANGJie，MEN(；-Chunmei，RONGSong!，ZHANGChao，HONGJian，WUJianxiang(1Institute0l，Biotechnology，CollegeofAgriculture&Biotechnology，ZhejiangUniversity，Hangzhou310029，China2．ZhejiangChuanhuaBiologicalTechno

4、logyCo．Ltd．，Hangzhou311231，China)ProkaryoticexpressionofthecoatproteingeneofOdontoglossumringspotvirus，preparationandapplicationofitspolyclonalantibodies．JournalofZhejiangUniversity(Agric．&IifeSci．)，2010，36(4)：375—380Abstract：00fog0ss“，"ringspotvirus(0RSV)isoneofthemostprevalentor

5、chidviruses．The477bpcoatproteingene(CP)ofORSVwasclonedfromthevirusinfectedorchidsamplesusingRT—PCR，andsubclonedintoaprokaryoticexpressionvectorpET一32a．Therecombinantprokaryoticexpressionvector(pET一32aCP)wasusedtotransformEscherichiacoliBL21(DE3)Anabout37kuthioredoxinA(TrxA)fusionp

6、roteinwasobtainedwithIPTGinductionandNi一NTAaffinitycolumnpurification．ThepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizerabbitsforproductionofpolyclonalantibodiesagainstthecoatproteinofORSV．Usingthepolyclonalantibodies，animmunocaptureRT—PCRandadotblotElISAwereestablishedforreliable，se

7、nsitiveandspecificdetectionofORSV．ThetwodetectionmethodsutilizingthepreparedpolyclonalantibodiesprovideabaseforthediagnosisoftheORSVdisease，theproductionofvirusfreeseedlingsandantivirusbreedingoftheorchid．Keywords：Odontoglossumringspotvirus；prokaryoticexpression；polyelonalantibody

8、；dot—blotE1ISA；immunocaptureRTPCR