花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备.pdf

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1、豆熬带槛钭孝2010,39(4)：4—6．花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备杨丽霞，一，宋涛平，彭新凯，胡朝晖，李玲2(1．长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙410013；2．华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631)摘要：采用RT-PCR方法，以花生叶片RNA逆转录得到的cDNA为模板，扩增出AhAO1基因片段，将其插入原核表达载体pPROEXHTa中，构建AhAO1基因片段原核表达载体HTaAhAO1，经PCR和测序确证后，以IPTG诱导其在Ec

2、oliBL21中高表达His—AhAO1融合蛋白，采用亲和层析柱与电泳纯化融合蛋白。用纯化的His。AhAO1融合蛋白制备抗体，为分析AhAO1的功能奠定基础。关键词：花生；AhAO1；pPROEXHTa；原核表达；抗体Doi：10．3969~．issn．1009—7791．2010．04．002中图分类号：Q943．2文献标识码：A文章编号：1009．7791(2010)04．0004—03ProkaryoticExpression，PurificationandPolyclonalAntibodyPr

3、eparationofPeanutAhAO1Pr0teinYANGLi—xia，，SONGTao—ping，PENGXin—kai，HUZhao—hui，LILing(1．ChangshaCenterofSupervision&InspectiononFoodQua1i够Salty，Changsha410013，HunanChina；2．GuangdongKeyLabofBiotechnologyforPlantDevelopment，CollegeofLifeScience，SouthChinaNorm

4、alUniversity,Guangzhou510631，GuangdongChina)Abstract：TheAhA01genewasisolatedbyr_PCRusingcDNAsynthesizedfromtotalRNAextractedfrompeanutleavesandclonedintoplasmidpPROEXHTla．Theexpressionplasmid}rraAhAo1wastransformedintoEcoliBL21．SDS—PAGeanalysisrevealedtll

5、attheHis—AhAO1fusionproteinwashighlyexpressedinEcoliBL21andpurifiedbvamnitychromatographyandelectrophoresis．TheHis-AhAOlpolyclonalantibodywaspreparedandtestedbywesternblot．1]heanti—HiS—AhAO1polyclonalantibodylaysfoundationforfurtherresearchonAllAo1．Keywor

6、ds：Arachishypogaea；AhAO1；pPROEXHTa；prokaryoticexpression；antibody醛氧化酶(aldehydeoxidase，AO)是钼单加氧酶和Fe—s黄素蛋白家族的成员【】J，与多种化合物的代谢过程有关。已知植物AO主要参与ABAL2J和IAAL3的生物合成。研究发现，纯化的玉米AO分子量约300kDa，由两个150kDa亚基组成。通过对其测序，克隆了两个A0cDNA(ZrnAO一1和ZmAO一2)j。目前从拟南芥【6J、豌豆L7】、番茄L8J和花生【】叫

7、等植物中克隆了AO基因。本文构建抗旱花生品种AhAO1基因片段HTaAhAO1原核表达载体，获得原核表达重组蛋白，并制备AhAO1抗体，为研究花生在干旱、盐等胁迫条件下的AhAO1蛋白表达及其作用奠定基础。1材料与方法1．1菌株、质粒和材料E．coliBL21、pPROEXHTa质粒为本实验室保存。1．2主要试剂镍亲和层析柱购自Novagen公司；各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、EXTaqDNA聚合收稿日期：2010—06—28基金项目：教育部科学技术研究重点项目(03098)作者简介：杨丽霞(

8、1981．)，女，河南安阳人，博士，从事植物分子生物学研究。注：李玲为通讯作者。第4期杨丽霞，等：花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备酶、DNA标准分子量购自TaKaRa公司；蛋白标准分子量购自天根生化科技有限公司；引物合成及序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。1．3HTaAhAO1重组表达载体的构建花生AhAO1基因片段PCR扩增引物：上游引物HTaAO1为5"-GAATI'CAAGGAAAGTGATGCA2TA