空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备.pdf

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1、第19卷第4期2010年4月武警医学院学报ActaAcademiaeMedicinaeCPAF271vo1．19No．4Apr．2010空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备简文，史皆然，樊爱琳，薛莹，李圣青’，柏银兰47戚好文(第四军医大学：1．西京医院呼吸内科；2．西京医院检验科；3．西京医院放疗科；4．基础部微生物教研室；陕西西安710032)摘要：【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1，并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因，用限制性内切酶消化后插入到pUC一

2、19克隆载体中，测序正确后，再亚克隆到融合表达载体pPro—EXHTb中，转化大肠杆菌DH5仪，目的基因经IPTG诱导，由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白，并经Westem—blotting证实。然后，在非变性条件下用Ni～NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB／c小鼠，制备多克隆抗体，用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni“一NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白，纯化获得的蛋白纯度大于90％。用该融合蛋白免疫小鼠后，得到抗PEB1抗体，效价达1：2x10。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PE

3、B1基因原核表达载体，并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗，对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。关键词：空肠弯曲菌；粘附蛋白；原核表达；纯化；多克隆抗体【文章编号】1008—5041(2010)04—0271—03【中图分类号】R392．11【文献标识码】AProkaryoticexpression，purificationofPEB1inCampylobacterjejuniandpreparationofitspolyclonalantibodyJIANWen，SHIJie-ran。FANAi—lin，XUEYing，LISheng

4、-qing，BAIYin-lan，QIHao-wen(DepartmentofRespiratoryDiseaseofXijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi‘fin710032，China)Abstract：【Objective]ToexpressCampylobacter何uniPEB1proteininprokaryoticcellsandpreparepolyclonalantibodyagainstit一【Methods】ThegeneencodingPEB1wasamplifiedfromge

5、nomeofCampylobacterjejunibypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintocloningvectorpUC-19．Aftersequenced，PEB1genewassubclonedintotheexpressionvectorpPro—EXHTband~ansformedintoE．coliDH5．AfterinducedbyIPTG．thebacteriacontrolledbyT7promoterexpressedthefusedPEB1proteinwithahexahistidinetail

6、atitsN-terminalandthetargetproteinwasidentifiedbyWestern-blotting．PEB1proteinwaspurifiedbyNi-NTApurificationsystemundernativecondition．UsingthisproteinasantigentoimmunizetheBALB／cmiceandpreparepolyclonalantibodyagainstPEB1wasprepared．Thentheproductionofanti-bodywasconfirmedbyELISA．【Resu

7、lts]Thefusionproteinwaspurifiedbymetalchelateaffinitychromatographyundernativecondition．PolyclonalantibodyagainstPEB1wasobtainedfrommiceimmunizedbyPEB1，Thetiterofwhichwas1：200000．【Conclusions】ThePEB1prokaryoticexpressionvectorhasbeensuccessfullyconstructed．PEB1proteinhasbeenobt