猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A、D基因与猪大肠肝菌LTB基因的重组、克隆及原核表达.pdf

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1、分类号：S墨521鱼5窆：鱼密级：公珏单位代学码：!QQ墨鱼号：2QQ墨垒5墨猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A、D基因与猪大肠杆菌LTB基因的重组、克隆及原核表达RecombinantCloningandExpressionoftheA，DGeneSproteinofTGEVandEscherichiacoil．Heat·labileEnterotoxinBSubunitGene学位申请人：刘媛指导教师：范京惠副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年五月二十九日独创性

2、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰垦壑些态鲎或其他教育机构的学证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：到翅L签字日期：>11年∥月乡日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。

3、本人授权塑皇垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：参l捌己导师签名：菇东麦签字日期：加ff年否月石日签字日期：劫，f年∥月7日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要㈨ff

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5、ffffI川fjI『I⋯㈣{Y189729S猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritisofswine，TGE)是由冠状病毒科冠

6、状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirusofswine，TGEV)iJl起的一种以呕吐、脱水、严重腹泻为主要特征的急性、高度接触性传染病。产肠毒素型大肠杆菌(EnterotoxigenicE．coil，ETEC)是引起仔猪腹泻的一种重要的肠道病原菌，能够引起仔猪黄痢和仔猪白痢等。根据GenBank中公布的TGEV的s蛋白A、D基因序列和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列，分别设计1对引物，采用RT-PCR技术扩增含A、D位点的Sl基因和LT

7、B基因，各自将其插入pET-28“+)载体中构建原核表达质粒，并进行PCR、酶切鉴定及序列测定。重组菌经诱导表达后，表达产物用SDS—PAGE和Western．blot进行检测。RT-PCR扩增得到了Sl基因片段，该基因全长980bp，编码262个氨基酸，序列分析显示SI基因与GenBank中公布的Sl基因序列同源性达97％以上，氨基酸序列同源性达95％以上，表明不同毒株Sl基因高度保守性。表达获得的Sl蛋白约33．7ku，并且表达产物主要以包涵体的形式存在；Western．blot分析表明，表达的Sl蛋白

8、可以被TGEV阳性血清所识别，具有反应原性。同样，PCR扩增得到的LTB基因全长375bp，编码124个氨基酸，序列分析显示LTB基因与GenBank中公布的LTB基因序列同源性达99％以上，氨基酸序列同源性达98％以上。表达获得的LTB蛋白约14ku。Western．blot分析表明，LTB蛋白能被ETEC阳性血清所识别，具有反应原性。重新设计1个引物，使LTB基因的终止密码子TAG突变为TAC，且在其下游添加EcoRI酶切位点。另设计1个引物，在Sl基因上游引入EcoRI酶切位点，并以上述试验扩增的Sl

9、基因和LTB基因为模板，再次进行PCR扩增，扩增产物经酶切和连接等技术重组成LTB2．S1_2基因，该基因全长1371bp，编码461个氨基酸。将LTB2-Si-2插入pET-28a(+)中构建重组原核表达质粒。诱导表达获得约45lcu的融合蛋白，并且主要以包涵体的形式存在。Western-blot分析表明，表达的目的蛋白能被TGEV阳性血清或ETEC阳性血清所识别，表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为开发和生产同时抗TGEV与ETEC的基因工程亚单位疫苗提供了物质基础。关键词：TGEV；Sl基因；ETEC；L

10、TB基因；克隆；原核表达RecombinantCloningandExpressionoftheA，DGeneSproteinofTGEVandEscherichiacoliHeat-labileEnterotoxinBSubunitGeneAUthor：Liu地anSupervisor：Prof．FanJinghuiSpecialty：PreventiveVeterinarymedicineAbstractTr