猪α1 干扰素基因的克隆与原核表达

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1、中国农学通报2010,26(11):1-6ChineseAgriculturalScienceBulletin猪α1干扰素基因的克隆与原核表达1211杨永胜，陈春花，宋勤叶，左玉柱（1河北农业大学动物科技学院，河北保定071001；2河北省邯郸市动物疫病预防控制中心，河北邯郸056005）摘要：根据猪α1干扰素（pocineinterferon-alpha1，poIFN-α1）的全基因序列（EU364896）设计合成1对特异引物，通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因，将该基因克隆到p

2、GEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1，进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板，经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因，将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白诱导表达和鉴定，并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明，克隆的poIFN-α1基因全长546bp，编码181个氨基酸，前23个氨基酸组成信号肽，无糖基化位点。SDS-PAGE和Westernblotting证实重组表达菌经IPTG诱导

3、后，可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白（GST-poIFN-α1）。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时，蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性，开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。关键词：猪α1干扰素；克隆；原核表达；鉴定中图分类号：S852.4文献标志码：A论文编号：2009-2772CloneandProkaryoticExpressionofPorcineInterferon-α1Gene1211YangYongsheng,ChenChunh

4、ua,SongQinye,ZuoYuzhu(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baodinghebei071001;2HandanCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Handanhebei056005)Abstract:Apairofspecificprimerforporcineinterferon-alpha1(poIFN-α1)wasdesignedandsynthes

5、izedaccordingtogenesequence(EU364896),andpoIFN-α1genewasamplifiedbyRT-PCRfromperipheralsbloodlymphocytes(PBLC)ofternaryhybridpiglet.ThenpoIFN-α1completegenewasclonedintopGEM-Tvectorandsequenced.Moreover,poIFN-α1genewithenzymesiteswasclonedintoprokaryoticexpressi

6、onvectorpGEX-6P-1toconstructrecombinantexpressionplasmidpGEX-6P-poIFN-α1andtransformitintoE.coliBL21(DE3).RecombinantpoIFNα1wasexpressedandidentifiedwithexpressionconditionsconfirmed.TheanalysisofsequenceindicatedthattheclonedpoIFN-α1geneconsistedof546bpencoding

7、181aminoacidswithasignalpeptideof23aminoacidsbutwithoutglycosylationsite.Theselectedrecombinantexpressedapproximatelya46kufusionproteinwithglutathioneS-transferase(GST)andpoIFN-α1whichwasdemonstratedbySDS-PAGEandWesternblotting.Theamountoffusionproteinreachedthe

8、highestwhentherecombinantswereinducedfor9hourson37℃with1.0mmol/LIPTG.CloneandexpressionofpoIFN-α1genelaidafoundationforthestudyofantiviralactivityandutilizationofpoIF