广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

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1、[堕丕兰!!堕堡塑主堂堡丝塞￡堕塑竖型查±!：±垫茎箜塞堕兰堕垫塞鲨广西沼泽型水牛丫一干扰素基因的克隆与原核表达摘要干扰素(IFN)是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。干扰素分为I型和II型，r干扰素(IFN嘲属于II型干扰素，是由T细胞和NK细胞产生的，具有广谱抗病毒作用，也具有上调主要组织相溶性复合物II(majorhistocompatib．

2、jtycompJe×II，MHCII)类抗原分子的表达等作用，是影响机体细胞和体液免疫反应的一类具有多种调节效应的细胞因子。本实验从健康沼泽型水牛静脉无菌采血，分离外周

3、血单个核细胞(PBMC)，用刀豆素A(ConcanavaI．nA，ConA)诱导培养13、17h后，提取细胞总RNA，用水牛lFN-丫基因特异性引物通过RT-PCR扩增了水牛JFN_丫的完全编码区cDNA序列和成熟肽编码区cDNA序列，将其克隆至IJpMDl8-T载体中，经序列分析表明，水牛IFNl编码区cDNA共有501bp，其序列与GenBank上报道的印度水牛JFNl核苷酸序列同源性高达99．6％，与牛、羊、猪、狗、马、人和鼠的同源胜分别为97．8％、96．嘶、85．8％、82．4％、81．o％、75．05；}n60．7％。氨基酸序列与

4、印度水牛同源性1005．与牛、羊、猪、狗、马、人和鼠的同源性分别为97．6％、95．2％、77．1％、77．1％、76．5％、60．8％幂940．6％。．44}IFN-y成熟肽编码区基因亚克隆到表达载体pET-32a+中，构建重组表达质粒pET-mIFNl，重组质粒转化大肠杆菌汇co／i)BL21，于37。C经IPTG诱导表达7小时，SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌中获得了高水平表达，表达的融合蛋白分子量约为35kD，且表达产物占菌体总蛋白的43．6％。本试验成功地克隆、表达了水牛JFNl，为下一阶段水牛lFN_丫重组蛋白生物学特性及

5、其应用的研究奠定了基础。关键词：沼泽型水牛：Y-干扰素：基因克隆：原核表达[耍盔堂；!堂旦堡圭堂垡迨奎亡耍塑翌型查±!：王垫壅盟塞堕量堡堡壅鲨CLONINGANDPROKARYOTICEXPRESSIONOFGUANGXISWAMPTYPEBUFFALOINTERFERON-,／GENEABSTRACTInterferonisakindofhi曲lyactiveandmulti-functionalglucoproteinproducedbyactivatedcells．InterferonisdevidedintoclassIandclas

6、sII．Interferon吖(ⅢN—DbelongstoclassII．BuffaloIFN-?isanantivimlcytokineproducedbyactivatedTcellsandNKcells．ItupregulatsMHCIIantigenexpression，influencesthecellularandhumoralimmuneresponsesandhaspleiotropicregulatoryeffectsonimmunesystem，Inthiswork，thetotalRNAwasextractedfromp

7、eripheralbloodmononuclearcells(PBMC)，isolatedfromthreehealthyswamptypebuffaloandstimulatedwithConAfor13and17hours，respectively．AndthecDNAofbuffaloIFN-ygenewasamplifiedbyRT—PCRusingapairofprimersdesignedaccordingtothepublishedbovineIFN吖genesequence．ThePCRproductwasclonedinto

8、pMDl8-Tvector．Then，sixofthepositiverecombinantclonesweresequencedandanalyzed．ComparisonofthesequencedIFN吖withthereportedIndianbuffaloIFN—vsequenceinGeneBankrevealed99．6％identityatthenucleotidelevel，andshares97．8％，96．0％，85．8％，82．4％，81．O％，75．O％and60．7％identitieswithbovine，goa

9、t，pig，dog，horse，humanandmouseIFN吖geneinnucleotide，respectively．Comparingwiththerep