shRNA慢病毒质粒的构建技巧_秦俊文.pdf

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1、DOI：10.13523/j.cb.20110322中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2011，31(3):124-127殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏檪檪读者来信檪檪殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏*shRNA慢病毒质粒的构建技巧1，2＊＊1，2＊＊233秦俊文谢琪璇蔡冬青秋山泰身井上纯一郎(1暨南大学生殖免疫研究所广州5106322暨南大学再生医学教育部重点实验室再生医学香港中文大学-暨南大学联合实验室科技部及广东省科技厅国际科技合作基地广州510632)(3东京大学医科学研究所分子发癌分野东京108-8639)携

2、带shRNA慢病毒质粒的慢病毒宿主范围广，能感染分裂期与非分裂期细胞，转染效率高，shRNA在宿主细胞中能高效、长期稳定地表达，因此shRNA慢病毒载体正被越来越广泛地应用于RNAi研究和疾病治疗中。然而，shRNA慢病毒质粒设计的合理性直接影响RNAi的效果。构建shRNA慢病毒质粒时综合利用多种设计和构建技巧，包括合理选择与靶基因同源的特异性核苷酸序列并作适当改变，以及选择合适的loop核苷酸序列等都将大大提高shRNA抑制靶基因表达的效果。这些方法对shRNA的设计和shRNA慢病毒质粒的构建具有重要的参考和指

3、导意义。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(double-strandRNA，［1］dsRNA)对靶基因转录后的mRNA的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默现象。RNAi现象最初是［2］由Fire等研究线虫时发现的;此后，RNAi的研究取得了突飞猛进的发展。由于RNAi抑制靶基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，现已被广泛应用于基因功能分析、细胞内信号转导通路研究，以及抗肿瘤、抗病毒和基因［3-7］治疗中。最初的RNAi实验采用体外合成小干扰

4、RNA(smallinterferenceRNA，siRNA))的方法，但存在费用昂贵、转移到细胞内的siRNA半衰期短、其本身不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而使其应用受到较大的限制。而将小发卡状RNA(smallhairpinRNA，shRNA)载体导入细胞后，能在细胞内稳定地转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性siRNA，因此可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。普通的shRNA非病毒性载体虽可转染到周期性分裂期细胞中，但几乎无法将其转染到非分裂期细胞、原代细胞、未分化细胞以及人和动

5、物个体中去。而利用病毒包括腺病毒(adenovirus)、逆转录病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)等来转染shRNA病毒性载体，因其转染效率高、操作简便以及shRNA在宿主细胞中能高效、稳定地表达等优势已被广泛用于RNAi的研究和治疗中。特别是携带shRNA载体的慢病毒，有着广泛的宿主范围，能感染［6］分裂期与非分裂期细胞，并能将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达shRNA的目的;而且产生的shRNA靶向性好，可有效抑制靶基因表达。此外，产生的慢病毒可进一步浓缩，从而大大提

6、高其转染效［8］［9］率。与腺病毒和逆转录病毒相比，慢病毒本身对宿主几乎不产生免疫原性，因而具有更高的安全性。基于上［10］述特点，表达shRNA的慢病毒载体除可广泛应用于周期性和非周期性细胞、干细胞等的基因功能研究外，也为［11-14］原代细胞乃至动物个体基因功能的研究提供了可能性，同时也使人和动物的基因沉默治疗成为可能。然而，现阶段大多数shRNA慢病毒质粒产生的shRNA，其抑制靶基因表达的效果并不尽如人意。究其原因，多与shRNA慢病毒质粒的设计和构建缺陷有关。shRNA慢病毒质粒由慢病毒载体、U6或H1RN

7、A启动子、与靶基因同源的特异性核苷酸序列正义链和反义链、收稿日期:2010-11-01修回日期:2011-01-08*广东省自然科学基金(9451063201002016)、暨南大学引进人才科研启动基金(51209004)、中央高校基本科研业务费专项资金(21610406)资助项目＊＊通讯作者，电子信箱:tjunwen@jnu．edu．cn，txqx@jnu．edu．cn2011，31(3)秦俊文等:shRNA慢病毒质粒的构建技巧125loop序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子构成(图1)。通过RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6

8、或H1的作用，转录生成shRNA，其在细胞内进一步加工生成靶基因特异性siRNA。图1shRNA慢病毒质粒的构件和shRNA示意图Fig．1ThemapoflentiviralshRNAplasmidandshRNAshRNA慢病毒质粒产生shRNA阻断靶基因表达的作用与其最适化构建是密不可分的。在构建shRNA慢病毒质粒的过程中，与靶基因同源