果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备.pdf

《果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第25卷第1期湖南理工学院学报(自然科学版)VO1．25No．12012年3月JournalofHunanInstituteofScienceandTechnology(NatttralSciences)Mair．2012果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备杨哲，雷曼音，廖四芳，王跃群，吴秀山(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，长沙410081)摘要：Nfat基因在血液发育中具有重要作用．根据已报道(~Nfat基因序列，以果蝇胚胎cDNA为模板，通过PCR扩增Nfa绑分编码序列，并将其连接到pET．28A原核表达载体上，经过双酶切以及测序鉴

2、定成功后，将重组质粒转"96E．coliBL21．在37~C时，通过IPTG诱导表达融合蛋白，通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白，然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，并用WesternBlotting检测抗体的效价以及特异性．结果表明，获得的Nfat~k克隆抗体特异性较强，为后期Nfat基因的研究工作奠定了基础．关键词：Nfat；果蝇；融合蛋白；多克隆抗体中图分类号：Q71文献标识码：A文章编号：1672．5298(2012)01．005304PolyclonalAntibodyPreparationofBloodDevelopment．GeneNfatinDrosophilaY

3、ANGZhe，LEIMin—yin，LIAOSi—fang，WANGYue—qun，WUXiu—shan(TheCenterforHeartDevelopment，KeyLabofMOEforDevelopmentBiologyandProteinChemistry，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China)Abstract：Nfatplaysaveryimportantroleinthedevelopmentofblood．ThepartofencodingsequenceofDrosophilaNfatwasamplifiedwithPC

4、RfromcDNAofembryoofDrosophila．andinsertedintopET．28avectorinframe．Therecombinantplasmidwasidentifiedwithenzymedigestionandsequencing．ThecompetentcellsofhoststrainofBL21weretransformedbytherecombinantplasmid(pET28a—Nfat)．ExpressionofthetargetproteinwasinducedwithIPTGat37~C．Thefusionproteinwaspuri

5、fiedbyureaandseparatedbvSDS．PAGEandrecoveredbygelextraction．ThentheNewZealandwhiterabbitswereimmunedwithpurifiedrecombinantproteintogenerateantibody．TheantibodytiterandspecificitywasidentifiedbyWesternblotting．Theresultsshowedthathighspecificityanti-Nfatpolyclonalantibodywasgenerated，whichprovid

6、edausefultoolforthefurtherstudiesofNfatfunction．Keywords：Nfat；drosophila；fusionprotein；polyclonalantibody果蝇作为熟知的模式生物，具有以下几个方面的优点：①个体小，易培养，一般在一个小试剂瓶中可培养上千个果蝇，且只需喂饲十分廉价的食物；②繁殖迅速，繁殖能力强；生命周期短，生活史包括卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段；在实验室条件下，一般12天就可完成世代交替；③在显微镜下甚至用肉眼就能区分雌雄，这十分有利于遗传分析；④具有几十个易于诱变分析的遗传特征，并保持有大量的突变体⋯．血液正常的发育对

7、于机体的生长和发育相当重要．血液主要有以下几个功能：①运输．运输是血液的基本功能，自肺吸人的氧气以及由消化道吸收的营养物质，都依靠血液运输才能到达全身各组织．②参与体液调节．激素分泌直接进入血液，依靠血液输送到达相应的靶器官，使其发挥一定的生理作用．③保持内环境稳态．由于血液不断循环及其与各部分体液之间广泛沟通，故对体内水和电解质的平衡、酸碱度平衡以及体温的恒定等都起决定性的作用．④防御功能．机体具有防御或消除伤害性刺激的能力，涉及多方面，血液