新基因znfd的克隆及其多克隆抗体的制备

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1、新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备：史群芳杨世蕊，雷陈，孟祥勋，黄超群，王明华【摘要】目的：PCR扩增得到新基因ZNFD（Znfdomaincontainingprotein），构建pET32a-ZNFD原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：通过PCR的方法克隆新基因ZNFD，选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列，克隆到原核表达载体pET32a上，利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和ethods：TheORFfragmentofZNFDplifiedbyPCRands

2、equenced.PartofORFpET32a-ZNFDplasmid.His-ZNFDi(DE3)inducedbyIPTGandpurifiedbyusingaffinitychromatography.PurifiedHis-ZNFDmunizerabbitstopreparepolyclonalantibody.Rabbitserumspecificityanditstiteroleculari(DE3)munizingrabbitonstratedthatthepurifiedantigenhadhighantigenicity.Conclusions：ZNFDgeneeras

3、echainreaction锌指（zincfingermotif）是存在于真核细胞转录因子中的重要结构域之一。1988年Pabo等对锌指下了一个定义：在调节蛋白一小段氨基酸序列中，含有几个Cys残基，这些区域为依赖锌的DNA结合域，它通过结合Zn2+自我折叠形成短的稳定的“手指”样结构[1]。锌指类蛋白广泛存在动植物和微生物中，它可选择性的结合特异的靶结构，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化和成熟等生命过程[2]。从酵母到人体，其中人类基因组中可能有将近1%的序列编码含有锌指结构的蛋白质[3]。1995年Klug等指出锌指蛋白基因这类转录因子与其他转录因子一样，具有重要的基因调控作用。

4、锌指蛋白与胚胎发育、细胞分化以及人类许多疾病相关[4~6]。本实验室使用电子克隆的方法获得了一个人类新基因,基因号为AY692447，将其同GenBank数据库相比较获得了该基因的可变剪切序列ZNFD，基因号为NM_182761[7]尚未被研究，本实验室便对这个新基因展开了初步的研究。首先通过PCR克隆得到了ZNFD基因，经测序验证，证实其在人体内真实表达。然后对ZNFD基因进行生物信息学分析，该基因含有典型的C2H2型锌指结构，此类锌指蛋白基因具有重要的基因调控作用。基于以上的分析，我们成功的构建了原核表达载体pET32a-ZNFD，并表达纯化了蛋白，免疫家兔得到了多克隆抗体，为以后进一

5、步研究该基因功能奠定了基础。1材料与方法1.1材料菌株E.coliRosetta-gami(DE3)、E.coliTop10、质粒pET32a由本实验室保存。人的睾丸cDNA文库购于Clontech公司。限制性核酸内切酶、TaqDNA聚合酶、pfu高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶、pMD19-T载体、DNAMarker为TaKaRa（日本）公司产品。HRP标记的羊抗兔IgG、ECL试剂、PVDF膜购于碧云天（中国）。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂及其它生化试剂购于上海生物工程技术有限公司（中国）。新西兰大白兔购于苏州大学动物中心。1.2方法1.2.1PCR克隆人ZNFD基因登陆GenBa

6、nk数据库，获得一个人类的新基因ZNFD，基因号为NM_182761,使用PrimerPremier5.0软件设计引物。PCR扩增该基因ORF引物：znf-up：5'-CATGAAACGACGACAAAAGAG-3'，znf-dool；dNTP（10mmol/L），1μl；DNA聚合酶3U。扩增条件：95℃预变性5min；94℃30s、52℃30s、72℃1min，共36个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，连接到pMD19-T载体上，由上海生物工程公司进行DNA测序。1.2.2人ZNFD基因的核酸和蛋白质的特征分析通过UCSCGenomeBl

7、atServer的人类基因组已有的数据，确定ZNFD基因的基因组结构以及染色体定位。使用NCBI中的ORFfinder软件进行阅读框架的识别，按照GT-AG规则确定外显子与内含子的交界。以Protparamtool软件进行等电点和分子量计算。利用SMART网上分析工具进行结构域预测，以PSORTServer进行蛋白细胞内定位预测。利用NCBI中的Unigene数据库进行表达谱分析。1.2.3原核表达载体的构建与表达PCR