新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备.doc

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1、新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备作者：史群芳杨世蕊，雷陈，孟祥勋，黄超群，王明华【摘要】目的：PCR扩增得到新基因ZNFD（Znfdomaincontainingprotein），构建pET32a-ZNFD原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：通过PCR的方法克隆新基因ZNFD，选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列，克隆到原核表达载体pET32a上，利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Westernblot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基

2、因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD，在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达，得到相对分子质量约为45kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔，制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论：得到纯化的ZNFD蛋白，制备的多克隆抗体达到了一定的效价，且具有高特异性，为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。【关键词】ZNFD基因；锌指；原核表达；免疫抗原；多克隆抗体；聚合酶链反应[Abstract]Objective：TocloneZNFDgenebyPCR,constructexpressionvectorZNFD-pET32a,prepareandobta

3、initspolyclonalantibody.Methods：TheORFfragmentofZNFDwasamplifiedbyPCRandsequenced.PartofORFwasclonedintopET32aprokaryoticexpressingvectortoformpET32a-ZNFDplasmid.His-ZNFDwasexpressedinE.coliRosetta-gami(DE3)inducedbyIPTGandpurifiedbyusingaffinitychromatography.PurifiedHis-ZNFDwasusedtoimmunizera

4、bbitstopreparepolyclonalantibody.RabbitserumspecificityanditstiterweredetectedbydoublediffusionandWesternblot.Results：TheZNFDgenewasclonedandsequenced,andthenpET32a-ZNFDwasconstructedsuccessfully.His-ZNFDprotein,45kDmolecularweight,canbeexpressedinE.coliRosetta-gami(DE3)withhighefficiency.Itscor

5、respondingantibodywasobtainedbyimmunizingrabbitwiththepurifiedprotein.ThedataofdoublediffusionandWesternblotdemonstratedthatthepurifiedantigenhadhighantigenicity.Conclusions：ZNFDgenewasclonedandthepurifiedfusionproteinZNFDwasobtained,ithadhighantigenicity.Polyclonalantibodywasprepared,whichprovi

6、dedreliabletoolsforthefutureresearch.[Keywords]ZNFDgene;Zincfinger;Prokaryoticexpression;Antigenicity;Polyclonalantibody;Polymerasechainreaction6锌指（zincfingermotif）是存在于真核细胞转录因子中的重要结构域之一。1988年Pabo等对锌指下了一个定义：在调节蛋白一小段氨基酸序列中，含有几个Cys残基，这些区域为依赖锌的DNA结合域，它通过结合Zn2+自我折叠形成短的稳定的“手指”样结构[1]。锌指类蛋白广泛存在动植物和微生物中，

7、它可选择性的结合特异的靶结构，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化和成熟等生命过程[2]。从酵母到人体，其中人类基因组中可能有将近1%的序列编码含有锌指结构的蛋白质[3]。1995年Klug等指出锌指蛋白基因这类转录因子与其他转录因子一样，具有重要的基因调控作用。锌指蛋白与胚胎发育、细胞分化以及人类许多疾病相关[4~6]。本实验室使用电子克隆的方法获得了一个人类新基因,基因号为AY692447，将其同GenBank数据库相比较获得了该基因的可