斑马鱼cfl基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

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1、第25卷第4期湖南文理学院学报(自然科学版)、b1．25NO．42013年12月JournalofHunanUniversityofAnsandScience(NaturalScienceEdition)Dec．2013doi：10．3969~．issn．1672—6146．2013．04．006斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析王盼盼，彭夕洋，易珍，江志刚，邓云，吴秀山，万永奇(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081)摘要：在心脏发育过程中，相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDN

2、A文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸，含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能，采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中，经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达出pET-28a．CFL融合蛋白，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的7l％，融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后，免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证，具有较好的特异性和较高的效价，可以用作western．blot免疫印迹等实验分析．关键词：CFL基因；融合蛋白：多克隆抗体中图分类号：

3、Q75文章编号：1672．6146(2013)04．0024．05ProkaryoticexpressionandpurificationofthezebrafishCFLgeneandpreparationofitspolyclonalantibodyWANGPan-pan，PENGXi-yang，YIZhen，JIANGZhi·gang，DENGYun，WUXiu—shan，WANYong-qi(TheCenterforHeartDevelopment，KeyLabofMOEforDevelopmentBiologyandProteinChemistry,HunanNormalUniv

4、ersity,Changsha410081，China)Abstract：Thenormalexpressionofrelatedgenesiscriticalintheheartdevelopmentprocess．Toexploretheheartdevelopmentrelatedgenes，toprovidethebasistounderstandthepathogenesisofcongenitalheartdiseaseandinterventionaltreatment．CFLgeneisacandidategeneforheartdevelopmentfromZebrafi

5、shcDNAlibrary．BioinformaticsanalysisrevealedthatitcontainsCXXCdomain，andencoding278aminoacids．TofurtherinvestigatethepossiblefunctionsofCFLintheprocessofheartdevelopment，thefulllengthofCFLgenewasclonedandinsertedintopET-28avector．TheHis-CFLfusionproteinwasinducedbyIPTG,theexpressionoffusionprotein

6、accountsfor71oftotalbacteriaprotein．Therelativemolecularmassisabout30kD．Afterinclusionbodypurification，immunetheNewZealandwhiterabbittopreparedpolyclonalantibodyandwasindentifitedbywesternblot．Theseresultsdemonstratethatthehightiterpolyclonalantibodywasobtained．Keywords：CFL；fusionprotein；polyclona

7、lantibody随着医学的发展和医学知识的普及，人类健康状况发生了显著改善，平均寿命得到延长．在工业发达地区，常见的致残或者致死的疾病曾经是以传染病及营养缺乏疾病为主，目前却逐步向慢性疾病转变，比如心血管疾病和肿瘤等．据世界卫生组织的资料，全球近l／3的死亡人数是由心血管疾病所致，心血管疾病是中低收入国家面临的一个重大问题．并且越来越多的人正在受到高血压和糖尿病等病症的威胁¨．在我国，心血管疾病的发病率和死亡率一直呈持