斑马鱼中囊胚发育相关基因的克隆及功能研究

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1、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文斑马鱼中囊胚发育相关基因的克隆及功能研究姓名：刘清云申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：李逸平20061201斑马鱼中囊胚发育相关基因的克隆及功能研究摘要中囊胚转换(Midblastulatransition，MBT)是在爪蟾，果蝇等胚胎发育过程中一个关键的事件。在哺乳类动物中也有类似现象发生。在MBT前的有丝分裂，只有s和M期，其发育过程受母型基因调控，合子型基因几乎没有转录活动。进入MBT之后，才恢复正常的细胞周期控制。cyclinH／cdk7组成的复合物，具有CAK(cdkactivati

2、ngkinase)的功能，又是TFIIH转录因子的组成之一，TFIIH通过磷酸化RNA聚合酶(polII)的最大亚基的C末端(CTD)，具有调节RNA聚合酶的功能。在斑马鱼中，cyclinH／cdk7在MBT时扮演什么角色?从未见有研究报道。在本研究中，两个新的编码斑马鱼cycli12H和cdk7的cDNA被克隆，经序列和进化树分析，表明它们分别和人类的cyclinH和cdk7有很高的同源性。RT—PCR和整胚原位杂交实验表明这两个基因均为母源表达。在早期胚胎发育过程中，这两个基因的转录本都是普遍表达，当发育到受精后第五天(dayspost—fertilization

3、，dpf)时，cyclinH和Cdk7主要在前部神经管，脑，眼睛，生殖器官，肝脏和心脏表达。但Cdk7的表达量低，而且相对更集中。在卜4细胞时过表达CyclinH或显性失活的CyclinII,发现过表达cyclin膊致尾部发育畸形；过表达显性失活的CyclinH影响早期胚胎合子型基因转录的起始，导致胚胎在5hpf时提前发生凋亡；并导致CyclinH内源表达较高的组织和器官发育畸形。这些结果表明CyclinH在斑马鱼早期胚胎发育中是一个必需的基因。曾有报道通过Ethylnitrosourea(ENU)等大规模诱变发现了与MBT发育相关的一些基因。但对MBT发育过程中的其

4、它相关基因还未完全揭示出来。本研究应用美国Affymetrix公司的斑马鱼基因表达谱芯片，对斑马鱼MBT前后的基因表达差异进行了研究。2．5hpf和4hpf芯片分析结果显示，有360个基因表达上调，119个基因表达下调。通过GeneOntology(GO)分析，表明其中某些基因与MBT相关并具有重要作用。我们选择研究的基因要满足两个条件之一：选择表达上调率幅度较大的或选择与细胞分裂，细胞周期调控有关的基因。对选择的基因或EST序列进行PCR验证实验，证实被筛选出的这类基因在／vlBT前后的表达水平有明显差异。这些基因在hIBT中的功能尚需进一步研究。关键词：cycli

5、nH，cdk7，中囊胚转换(MBT)，整胚原位杂交，芯片中国科学院上海生命科学研究院生物化学与缅瞻生物学磅究所溥士学位论文斑马鱼中囊胚发育相关基囡的克磋及功能研究^bstractOingyunLiuDirectedbyYipingLiThemidblastulatransition(MBT)representsamajorphaseinembryonicdevelopment．PriortotheMBT，theearlystageofembryodevelopmentismostlYregulatedbymaternalgenesandshowsaverylowlev

6、eloftranscription．AlthoughCdkT／CyclinHhasalsobeenimplicatedtobeinvolvedintheregulationofCdk—activatingkinase(CAK)andofRNApolymerase，thefunctionoftheseorthologuesinzebrafishMBThasnotbeenfullyelucidated．Inthecurrentstudy，twonovelcDNAsencodingCyclinⅣandCdk7wereclonedfromzebrafishblastulaem

7、bryos．SequenceanalysisdataandPhylogeneticparsimonytreeanalysissuggestedzebrafishCyclinHandCdk7cDNAwereconservativetothehumanorthologuerespectively．RT—PCRandwhole-mountinsituhybridization(ISH)analysis，suggestedthatCyclinHandCdk7werematernallyloadedinembryosandorgansofadultfish．D