斑马鱼基因sema4c的克隆、表达和功能研究

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1、华中科技大学博士学位论文管在肿瘤转移中的研究才有较大的突破。MattilaMM把经VEGF-C转染的人MCF272细胞种植于裸鼠，采用抗FLT4的单克隆抗体标记肿瘤淋巴管，发现过表达VEGF-C可以刺激肿瘤淋巴管生成并诱导肿瘤细胞向局部淋巴结转移[5]。通过对肿瘤生长和转移过程中的一些关键环节进行干预，从而达到遏阻肿瘤转移，这是我们从事阻遏肿瘤转移研究的方向之一。1．2斑马鱼：科学研究的理想模式生物斑马鱼(Daniorerio，zebrafish)原产于东印度，巴基斯坦和缅甸的小溪稻田以及恒河中游。类属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼

2、鱼属(Danio)的一种硬骨鱼。是一种常见的小型淡水热带观赏鱼，因为其体侧有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。由于斑马鱼具有观赏性强和易饲养的特点，为很多的养鱼爱好者所喜爱。在20世纪70年代初，美国俄勒冈大学分子生物研究所从事遗传学研究的GeorgeStreisinger教授也在家中养了几尾斑马鱼。后来他甚至把它开始作为了试验的对象。1981年的时候，他首次在Nature上发表了关于斑马鱼人工雌核发育的研究论文[6]，从此斑马鱼开始受到生物学家们的关注，探索的序幕也由此拉开。其后斑马鱼作为一种理想的模式生物，被广泛的应用于科学研究，这是因为斑马鱼有以下的优点[7]:

3、1）成年鱼个体较小，对饲养条件要求较低斑马鱼块头不大，成年斑马鱼的体长仅4cm左右，雄鱼体型偏修长，雌鱼体型偏肥大，并且能承受高密度饲养——每升水中最多可容纳5尾成鱼。维持费用也很低，适宜在有限空间里大批量饲养，从而满足科研的需要。另外斑马鱼喜欢中性水质中生活，环境温度保持在25℃--30℃即可，对食物要求也不苛刻，因此很容易饲养。2）繁殖周期短，产卵量大斑马鱼胚胎发育快，在28.5℃培养条件下24pdh后，主要的组织器官原基已形成，这时可以看到明显的心脏搏动和血液流动，相当于28天的人类胚胎。在理想的养殖条件下，斑马鱼的性成熟期一般只要3个月左右。性成熟后斑马鱼每周可以进行交

4、配一次，通常一尾雌鱼每次可产卵200－400枚，斑马鱼维持稳定产5华中科技大学博士学位论文卵的周期可以达到两年以上。这是其它模式生物所不能比拟的，也是采用斑马鱼做饱和诱变和精确基因定位的原因之一。3）斑马鱼胚胎体外受精体外发育，躯体透明，便于观察和操作斑马鱼雄鱼精子排出体外，雌鱼卵子排出体外，两者在体外进行受精，受精后在体外发育成熟，整个胚胎通体透明，因此很容易透视观察鱼体内部、原肠期的细胞运动、血液的流动和心脏跳动等胚胎发育事件。受精卵的直径约有lmm，在普通的体视显微镜下就可以进行显微注射和细胞移植等操作。4）常用的胚胎和遗传学操作技术也可应用于斑马鱼胚胎先前所采用低等模式

5、动物(线虫、果蝇)进行细胞标记和细胞谱系跟踪，这一技术在斑马鱼上也很容易做到；爪蛙上进行的细胞移植技术在斑马鱼胚胎上也容易做到。关于进行基因功能方面的研究，现在发展成熟并常用的技术有转基因技术、基因过表达技术、反义干扰基因表达的技术、随机及靶基因定向诱变的技术、体细胞克隆技术等。这些技术在斑马鱼胚胎上都可以进行操作，因此斑马鱼是研究基因功能的一个理想模型。5）基因组序列的注释已完成当人类基因组序列注释完成后，科学家们宣言下一个要注释完成的便是斑马鱼的基因组序列。斑马鱼基因组测序工作主要由英国Sanger研究所承担，于2001年开始，目前已完成。斑马鱼共有25对染色体，已完成组装

6、的序列总长度为1.63×109bp，己注释的编码基因21503个、RNA基因3421个(http://vega.sanger.ac.uk/Danio_rerio/index.html)。斑马鱼基因组序列的注释推动了功能基因组学的研究，并且有详细的遗传图谱和物理图谱，克隆突变基因就容易多了。6）斑马鱼品系资源丰富目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为Tubingen品系、WILK品系、AB品系，其中Tubingen就是斑马鱼基因组计划所用品系。此外，全球现保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。随着更多的科研工作者利用斑马鱼这一模型从事科学研究，突变系和转基因系会越来越

7、多，这些丰富的品系资源将会为科6华中科技大学博士学位论文学研究带来更大的方便。7)斑马鱼与人类高度保守不论是从解剖结构和器官相似性上，还是从基因的功能上，斑马鱼与人类都有极高的相似性。并且在一些疾病的表型上，斑马鱼所出现的表型同人类疾病表型也是一致的，这就为人们利用斑马鱼从事人类疾病的研究提供了坚定的基础。通过上述的斑马鱼特点，不难发现斑马鱼拥有其它的模式生物所不能比拟的优点。如同小模式生物相比，因为线虫，果蝇或酵母属于无脊椎生物，它们在器官组成上同人类相比存在着很大的差异。跟大模式生物小鼠