文昌鱼和斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆、进化学分析、表达图式及斑马鱼gamt的功能研究

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1、山东大学博士学位论文文昌鱼和斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆、进化学分析、表达图式及斑马鱼gamt的功能研究姓名：王利凤申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：张红卫20070330山东大学博士学住论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：五亟l囝旦日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学

2、位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：难导师签名：阻日期：山东大学博士学住论文摘要头索动物文昌鱼代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物。以文昌鱼为模式动物研究脊椎动物发育的机制是比较胚胎学和发育生物学的重要内容。随着佛罗里达文昌鱼的全基因组测序的完成，必将使文昌鱼在发育分子生物学和基因

3、组进化学的研究中发挥更加重要的作用。斑马鱼高繁殖力、胚胎体外发育和透明性等优点，使其成为研究胚胎发育的绝佳材料。斑马鱼大规模遗传突变筛选显示，斑马鱼的很多突变表型与与人类相关疾病的临床症状有着相似的特征；基因组测序的数据也已经揭示，斑马鱼的这些基因与引起人类疾病的相应的基因有着极高的同源性。因此，斑马鱼这一模式动物也日益成为研究脊椎动物生物学、生理学和人类疾病最有力的工具．肌酸(cr)／磷酸肌酸(PCr)／肌酸激酶(cK)系统是脊椎动物体内能量供应的最重要的机制之一．体内肌酸的合成经两步酶促反应完成，第一步是精氨酸和甘氨酸在精氨酸甘氨酸转氨酶(AGAT)的催化下，合成胍基乙酸

4、和乌氨酸，第二步是胍乙酸(GAA)和S．腺甘甲硫氨酸(SAM)经胍基乙酸甲基转移酶(GAMT)的催化生成肌酸。肌肉等组织细胞自身不能合成肌酸，必须通过特殊的钠离子依赖的细胞膜肌酸转运蛋白(CTI)摄取血液中的肌酸。根据Cr代谢途径可以看出，cr合成的异常和转运的异常都可以引起肌酸缺陷综合症(CDS)。AGAT,GAMT和CTl缺陷症的病人共同的症状是幼年的神经学上的症状和严重的神经发育延滞。AGAT和GAMT缺陷症可以通过口服肌酸而缓慢的补充脑中肌酸，进而得到治疗。但口服肌酸不能补充CTI缺陷症病人中枢神经系统(CNS)中的缺失的肌酸。尽管服用肌酸可以使AGAT：iIIGAM

5、T缺陷症的病人发育得到恢复，但其仍然遗留脑的发育和智力的障碍。GAMT缺陷症可能是由CNS中堆积的GAA的毒性引起的。自1934年人们发现了肌酸激酶催化的反应以来，人们的研究焦点最初集中在肌酸激酶反应本身的生化、生理、病理及其作用等方面，随后逐渐转移到了肌酸代谢方面。人类CDS发现后，相当多的研究在临床和实验室中展开。尽管大多数的CDS或者都在儿童时期就表现出明显的症状，但是对胚胎发育中的肌酸9山东大学博士学位论文代谢，特别是从胚胎发育到成体的过程中肌酸合成与转运的变化的研究却非常有限。此外，肌酸合成与转运代谢的研究目前所有报道都是在脊椎动物。尤其是哺乳动物(大鼠、小鼠和人)

6、中开展的。AGAT和GAMT酶活性一度未在无脊椎动物动物中检测到。但一些无脊椎动物中却发现了一定的Cr，PCr和CK。头索动物文昌鱼中也存在CK。因此人们对于这些物种体内的肌酸是来自环境或者食物中，还是内源合成的(只是这些物种的肌酸合成酶尚未被检测到)一直有疑问。由于缺乏无脊椎动物以及低等脊椎动物中肌酸合成的证据，因此对于肌酸代谢途径从无脊椎到脊椎动物的进化研究就更无从谈起。本研究首次克隆到头索动物文昌鱼(白氏文昌鱼)的3个肌酸代谢相关基因，证实了无脊椎动物(至少头索动物)中确实存在肌酸的合成与转运机制，回答了人们长久以来关于无脊椎动物中肌酸来源的问题。整封和切片原位杂交的结

7、果显示，3个肌酸代谢相关基因在文昌鱼胚胎和成体中都表达，表明肌酸的合成与转运无论在头索动物胚胎的正常发育还是成体的正常生理活动中都可能起着极其重要的作用。本文还系统的研究了斑马鱼中agat、gamt和dJ在胚胎发育和成体中的表达图式，填补了鱼类中肌酸合成与转运研究的空白。本文在文昌鱼，尤其是斑马鱼胚胎发育中对3个肌酸代谢相关基因的研究，充实了人类对肌酸代谢与胚胎发育关系的认识，同时也为在模式动物斑马鱼中开展人类CDS的相关研究提供了一种可能思路。进化学的研究表明，文昌鱼与斑马鱼的AGAT、GAMT和CT