斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备.pdf

《斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、2010年6月湖南师范大学自然科学学报V01．33No．2第33卷第2期JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversityJun．，2010斑马鱼心脏标记基因p／tx2的多克隆抗体的制备王华，张云，吴秀山，袁婺洲(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，中国长沙410081)摘要pitx2基因是一类bicoid相关的同源异型框因子成员，介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化．pitx2基因位于Nodal信号途径的下游，直接由

2、Nodal信号分子控制．用PeR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区，并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切和测序鉴定后，将重组质粒(pGEX-4T-1比)转入BI21感受态细胞，通过IPTG诱导表达融合蛋白，用GST珠亲和纯化，将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并用WesternBlot检测抗体．获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体．提取斑马鱼不同器官和组织蛋白，用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况，发现

3、pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达，尤其在心脏中有很高的表达，表明制备的抗体特异性非常好．关键词pitx2；融合蛋白；多克隆抗体中图分类号Q812文献标识码A文章编号1000-2537(2010)02-0098-04PreparationofPolyclonalAntibodyofHeartMarkergenePitx2inZebrafishWANGHua，ZHANGYun，删XJu—shan，YUANWu—zhou(TheCenterforHeanDevelopment，KeyL

4、abofMOEforDevelopmentBiologyandProteinChemistry，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China)AbstractThepitx2geneisamemberofthebicoid—homeodomainclassoftranscriptionfactors，whichmedi—atesdifferentiationofheartleft·rightasymmetryandlateralityofinternalorga

5、ns．Pitx2hasbeenproposedtoactdownstreamofNodalsignalingpathwayandtobecontrolledbyNodalsignalingmoleculedirectly．Inthispaper，pitx2genewasamplifiedbyPeRandthenwasclonedintopGEX-4T一1vector．Afterconfirmedbyrestrictionenzymeandsequencing，therecombinantexpress

6、ionplasmidcontainingpitx2genewastransformedintoBI_,21ceilsandthepitx2fusionproteinwasinducedbyIPTG．ThepurifiedproteinwasobtainedbyGlulalhioneSepharoseandthenwasimmunedtheNewZealandwhiterabbitstoprepareantibody．Theantibodytiterandspecificationwasidentifi

7、edbyWesternBlot．GSTfusionproteinofpitx2havebeensuccessfullyobtainedandpreparatedhighsensitivityandspeci—ficityanti-pitx2polyclonalantibody．Differentzebrafishtissuesandorganswereusedtoextractproteinstodetectpitx2antibodyspecification．Theresultshowedthatp

8、itx2antibodyspecificallyexpressedinheart，brain，muscle，intestineandliver，suggestingthepitx2antibodywasspecific．Keywordspitx2；fusionprotein；polyclonalantibody脊椎动物表面看似两侧对称，但内部器官包括心脏最终都表现出左右不对称，心脏的不对称包括定位不对称和自身形态的不对称．心脏是脊椎动物器官发生过程中最早