果蝇血液发育标记基因Dox-A3多克隆抗体的制备.pdf

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1、2012年10月湘南学院学报0ct．．20l2第33卷第5期JotmaalofXiangnanUniversityVo1．33No．5果蝇血液发育标记基因Dox—A3多克隆抗体的制备苏勇，蔡哲彦，江志钢，袁婺洲，吴秀山(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室。心脏发育研究中心。湖南长沙410081)摘要：从野生型成体果蝇体内提取总RNA，以eDNA作为模板进行PCR扩增，获取Dox—A3部分基因片段，将这片段连接于原核表达载体pET一28a上，成功构建重组质粒pET一28a—Dox—A3．将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta，用lqT'G诱导表达出

2、融合蛋白，然后将经Ni—IDA凝胶柱纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备Dox—A3多克隆抗体，通过Western—Blot检测效价和特异性．结果表明，实验获得了高质量的多克隆抗体．关键词：Dox—A3基因；果蝇；原核表达；多克隆抗体中图分类号：Q71文献标识码：ADOI：10．39691j．jssn．1672—8173．2012．05．009遗传性心脏病是一类严重影响人类健康的疾病，该类疾病由一系列调节心脏发育的基因及其相关基因的突变而引起．利用模式动物来研究这些基因的功能是行之有效的方法，果蝇作为模式动物研究基因和生命现象已经有一百多年的历史，人们掌握了一整套果蝇的

3、遗传分析方法，便于进行遗传与发育的研究分析．果蝇模型具有个体小，易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短(约两周)、繁殖力强，便于进行表型分析等众多优点果蝇心脏发育是一个及其复杂的过程，它包括细胞的迁移，融合和各种特异性分化过程．现今人们已鉴定出许多与心脏发育相关的分子途径和信号通路．如DPP信号途径_2]、成纤维生子因子(FGF)信号途径、Notch信号途径、wnt信号途径等．果蝇有3种proPO基因，分别为Dox—A1，Dox—A2(CG8193)，Dox—A3(CG2952)．Dox—A1已经被证明是编码proPOA(1)，俩种亚型A(1)和A(3)中的一种．但

4、是，是由CG8193还是CG2952编码proPOA(3)依然不清楚．通过Northern分析，CG8193的表达在幼虫期很强烈，但CG2952的表达在任何时期都没有被发现．通过用CG8193的特异性抗体检测，然后免疫印迹分析观察到在幼虫的血淋巴中有内源性pmPOA(3)的迁移，但是没有CG2952信号．这些结果暗示了CG2952，也就是Dox—A3的表达非常低，CG8193是编码内源性proPOA(3)的基因!．那么Dox—A3在果蝇中表达的作用，以及其什么时期的表达最强烈都是一个值得探讨的问题．Dox—A3是果蝇血液发育的标记性基因，它只在果蝇血液中特异性表达．所

5、以，通过观察Dox—A3的表达情况我们可以分析果蝇血液发育过程中表达产物和信号通路中其他因子的相互作用，制备Dox—A3多克隆抗体具有重要的研究意义和应用价值．作者克隆了果蝇Dox—A3基因，成功实现了Dox—A3基因在原核生物中的表达，进而制备了高质量的Dox—A3多克隆抗体，为进一步深入研究果蝇血液发育调控机制奠定了坚实的基础．收稿日期：2012—03—08；修回日期：2012—05—03基金项目：国家自然科学基金项目(30671053，30871340，30930054，30900851)；国家重点基础研究发展计划项目(2005CB522505)作者简介：苏勇(

6、1985一)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，研究方向：心脏发育分子机制．通讯作者：吴秀山(1952一)，男，湖南衡阳人，教授，博士后，研究方向：心脏发育的基因调控．·33·湘南学院学报(自然科学版)2012年10月(第33卷)第5期1实验部分1．1主要实验材料与试剂大肠杆菌E．eoliDH5a，E．colirosetta菌株，均为本实验室保种；载体pMD18一T和DNA连接酶购白TaKaRa公司，载体pET一28a为本实验室提供；限制性内切酶XhoI与EcoRI、TaqDNA聚合酶购买自深圳品美公司；DNA胶收试剂盒购买自康为世纪公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；酵母提

7、取物、蛋白胨、氯化钠、丙烯酰胺、过硫酸铵、甲叉双丙烯酰胺、IPTG(异丙基一8一D一硫代半乳糖苷)、RNase等购自上海生l_l公司；新西兰大白兔购白中南大学湘雅附一医院．在NCBI(http：／／wwW．ncbi．【lm．nih．g0v)里面查到果蝇Dox—A3基因的全长，利用Peptideantigenfinder软件选出Dox—A3蛋白的氨基酸序列抗原性最佳的一段．用PrimerP~mier5．0软件设计引物，引物序列为：Sense：5’AGAA丌cccfAGATGAcCTCAAGGG3’EcoR1(划线部分为EcoRl酶切位点)；Anti—s