斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备.pdf

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1、2011年4月湖南师范大学自然科学学报Vo1．34No．2第34卷第2期JournalofNaturalScienceofHtmanNormalUniversityApr．，2011斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备李志，姚立群，雷孝锋，王琨，莫小阳，吴秀山(湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，中国长沙410081)摘要／oc558117基因是tr／m45在斑马鱼中的同源基因，小鼠及果蝇研究结果表明该基因与血细胞发育有关．利用PCR技术扩增斑马鱼Nc558117基因部分编码区，并将其插入到原核表达载体pET-28

2、a中，经过酶切和测序鉴定后，将重组质粒(pET-28a—bc558117)转入Rosseta感受态细胞，通过IPTG诱导表达融合蛋白，his柱子亲和纯化，将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并用WesternBlot检测抗体．获得了loc558117原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗loc558117多克隆抗体．为进一步研究~c558117功能提供了有力工具．关键词斑马鱼；loc558117；融合蛋白；多克隆抗体中图分类号Q785文献标识码A文章编号1000-2537(20l1)02-0075-04PreparationofPolycl

3、onalAntibodyofZebrafishLoc558117GeneL／Zhi，YAOLi—qun，LEIXiao-feng，WANGKun，MOXiao-yang，WUXiu—shan(TheCenterforHeartDevelopment，KeyLab．ofMOEforDevelopmentBiologyandProteinChemistry，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China)AbstractThe／oc558117geneisthehomologousgenesofthetrim45inzeb

4、rafish，previousstudiesshowedthatithadsomerelationswithhematopoiesisinmouseanddrosophila．Inthiswork，／oc558117genewasamplifiedbyPCRandthenclonedintopET-28avector．Afteridentificationbyrestrictionenzymeandsequencing，therecom—binantexpressionplasmidcontainingIoc558117genewastransformed

5、intoRossetaceUs．The1oc558117fusionpro—teinwasinducedbyIPTGandpurifiedproteinusinghis—IDAsephrose，theIoc558117fusionproteinwasusedtoimmunedtheNewZealandwhiterabbitstoprepareantibody．TheantibodytiterandspecificationwereidentifiedbyWesternblot．Hisfusionproteinofloc558117wasobmined，an

6、dhighsensitivityandspecificityanti—loc558117poly-clonalantibodywasgotten．Theresultswillbehelpfulforfunctionalstudiesofloc558117geneinthefuture．Keywordszebrafish；Ioc558117；fusionprotein；polyclonalantibody脊椎动物血液发育是一个错综复杂的过程¨．起源于热带的斑马鱼其心血管、血液、肝肾等系统与人类相应系统有许多相似之处，且斑马鱼易饲养，产卵数量多，具有体外受精、

7、胚胎发育快、透明等优点而被公认为是脊椎动物类研究的最佳模式动物，广泛应用于发育生物学、分子生物学、遗传学、胚胎学等领域．因此研究斑马鱼为研究脊椎动物血液发育作用机制，进而为血液疾病的治疗提供绝佳的平台．Trim45是trim家族中的一种，其在心血管发育方面有重要作用j．在斑马鱼中，trim33与smad家族蛋白作用，通过TGFfl信号通路来影响造血作用引．作为进化保守的tr／m45的同源基因，~c558117与trim33有收稿日期：2010．12-24基金项目：国家自然科学基金资助项目(31071999，30771170，30971105，3097166

8、3，30871340，30671053，30970425，3090