斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析.pdf

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1、2010年3月湖南师范大学自然科学学报V01．33No．1第33卷第1期JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversityMal"．，2010斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析朱婷，黄文，王跃群，李永青，袁婺洲，莫小阳，万永奇，吴秀山，邓云(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，中国长沙410081)摘要为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能，采用生物信息学结合RT—PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因．将所得片段插

2、人原核表达载体pGEX-4T-1中，并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白，经GST亲和层析法纯化后，免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体，利用westemblotting和免疫组化的方法对抗体进行分析．分析表明：斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627bp，编码208个氨基酸，与人Hand2蛋白的同源性达到83％；IPTG诱导表达后，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％，经GST纯化获得SDS—PAGE电泳下单一条带．融合蛋白相对分子质量约为49000．分析表明，制备的抗体具有很好的特异性．关键词hand2；斑马鱼；原核表达；多克隆抗体中图分

3、类号Q812文献标识码A文章编号1000—2537(2010)01-0108-06CloningandPolyclonalAntibodyPreparationofhand2GeneinZebrafishZHUTing，HUANGWen，WANGYue—qun，LIYong—qing，YUANWu-zhou，MOXiao—yang，WANy0一，聊Xdu—shan，DENGYun’(TheCenterforHeartDevelopment，KeyLabofMOEforDevelopmentBiologyandProteinChemistry，Hunan

4、NormalUniversity，Changsha410081，China)AbstractThehand2geneinzebrafishisclonedbybioinformaticscombinedwi山RT-PCRtechnique．thenhand2fragmentisinsertedintopGEX-4T一1vector．TheGST—Hand2fusionproteinisinducedbyIPTG．Afterpuri-ficationbyGSTaffinitychromatography，GST-Hand2fusionproteinisu

5、sedtoimmunetheNewZealandwhiterab—bitstopreparepolyclonalantibody．Theantibodyisassayedbywesternblottingandimmunohistochemistry．There-suitsshowthatzebrafishhand2genecodingregionhas627bp，whicheneods208aminoacids，has83％identifica—tionwithhumanHand2gene．TheGST—Hand2fusionproteinexpre

6、ssedinBL21accountsfor71％ofthetotalpro—teins．TheGST—Hand2fusionproteindisplaysasinglestrapinSDS—PAGEafterpurification，whosemolecularmassis49000．Thereportdemonstratesthattheantibodyhashighsensitivityandspecificity．Keywordshand2；zebrafish；prokaryotieexpression；polyclonalantibody已有文

7、献表明：碱性螺旋．环一螺旋(basichelix—loop．helix，bHLH)转录因子对骨骼肌细胞、造血细胞及一些神经元细胞。的分化起重要调节作用；也有bHLH家族成员与心脏及其他组织中的表达，肌细胞的发生、细胞增殖、组织分化以及其他重要的发育过程有关．Hand基因就是bHLH家族成员之一⋯．近来有文献报道hand基因对心脏发育有非常重要的调节作用，在心脏的发生过程中与外胚中胚层、心管和心室的发育收稿日期：2009—12—15基金项目：国家自然科学基金资助项Et(30671137)；湖南省教育厅优秀青年资助项目(06B053)}通讯作者。E·mai

8、l：dengyun2008@yahoo．eom．an第1期朱婷等：斑马鱼hand2基因的克隆、