Ghrelin基因敲除斑马鱼的脂代谢特征研究

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1、2018届研究生硕士学位分类号：论文学校代码：10269密级：学号：51151300074EastChinaNormalUniversity硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：Ghrelin基因敲除斑马鱼的脂代谢特征研究姓名：高爽学号：51151300074院系：生命科学学院专业：动物学方向：鱼类营养与代谢导师：杜震宇教授2018年5月23日UniversityCode:10269DissertationforMasterDegreein2018StudentID:51151300074EastChinaNormalU

2、niversityResearchofLipidMetabolisminGhrelinKnockoutZebrafishName:GaoShuangStudentIDNO.:51151300074College:LifeSciencesMajor:ZoologySpecialization:AquacultureNutritionandMetabolismSupervisor:Prof.ZhenyuDu23thMay2018高爽硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称单位备注冷向军教授上海海洋大学主席陈立侨教授华东师范大学李二超教授海南大学乔芳工

3、程师华东师范大学秘书华东师范大学2018届硕士研究生论文中文摘要当前，人类对优质蛋白源的需求日益增长，这大力地推动了水产养殖业和饲料行业的蓬勃发展。但与此同时，在水产养殖中也有很多实际问题日益凸显。其中，养殖鱼类体内脂肪过度沉积是当前普遍出现的营养性病症，它不仅严重制约着水产养殖业的健康发展，也对水产品安全造成潜在的威胁。因此，了解鱼类脂肪沉积的原理，并展开相关工作，是当前鱼类营养学研究的热门领域。本论文试图从内分泌代谢调控的角度，以斑马鱼为模型，探讨内分泌因子Ghrelin对斑马鱼脂肪沉积调控的机制，为更深入地理解鱼类脂肪沉积机理提供依据。本

4、研究采用TALENs基因编辑技术敲除Ghrelin基因的斑马鱼纯合体为实验动物（来自中国科学院水生生物研究所），运用营养学、生物化学、分子生物学、转录组学等相关技术方法，探讨Ghrelin基因对斑马鱼脂代谢的影响。我们在得到Ghrelin基因突变的斑马鱼纯合体(Ghrelin-/-)后，首先进行繁殖工作，来为后续的养殖实验培育出不同生长阶段且足够数量的斑马鱼。之后的工作分为以下几个方面：一.确定Ghrelin-/-斑马鱼幼鱼表型。具体实验包括：运动行为学的监测，用荧光染料标记的草履虫进行投喂实验，针对生长激素（GH）表达量的原位杂交实验；二.在

5、正常饵料投喂下，观察Ghrelin-/-斑马鱼成鱼表型。具体实验包括：将日龄均为10dpf、大小相同的野生型斑马鱼（WT/对照组）和Ghrelin-/-斑马鱼各10条放在同一水族缸中，设置三个平行处理，每天饱食投喂，混合喂养8周，实验结束后剪尾筛鱼测定相关指标；三．在高脂肪添加水平的饲料投喂（HighFatDiet，HFD）下，观察Ghrelin-/-斑马鱼成鱼表型。具体实验包括:将日龄均为45dpf，两种不同基因型的斑马鱼分开养殖8周，并分别定量（体重的4%）投喂不同脂肪添加水平（正常脂水平：7%；高脂水平：13%）的饲料。四个处理组分别为：

6、Ghrelin-/-高脂组、Ghrelin-/-正常脂组、WT高脂组、WT正常脂组，每组设置三个平行处理。每周对各缸斑I华东师范大学2018届硕士研究生论文马鱼进行称重，养殖实验结束后采集组织样品，并测定相关指标。最后，从高脂饲料投喂组的斑马鱼肝脏中提取RNA，进行转录组测序分析。关于Ghrelin-/-斑马鱼幼鱼的实验结果包括以下几个部分：1）用荧光染料ASP对草履虫进行染色，而后投喂给日龄为5dpf且未开口的两种基因型的斑马鱼幼鱼，在30min分钟内，发现Ghrelin-/-斑马鱼消化道内的荧光面积及强度要显著高于对照组，说明其摄食量要高于

7、野生型斑马鱼幼鱼。2）运动行为学的检测结果表明，Ghrelin-/-斑马鱼在日间运动活跃,且活跃程度要显著强于对照组，而在夜间没有明显差异。3）在原位杂交实验中，两种基因型斑马鱼幼鱼垂体中的生长激素（GH）含量接近，没有显著差异，说明Ghrelin作为生长激素促分泌素受体（GHSR）唯一的内源性配体，其缺失并没有直接影响斑马鱼幼鱼中GH的表达量。总的来说，幼鱼实验表明，Ghrelin在斑马鱼幼鱼上至少表现出两项生理功能：维持斑马鱼幼鱼的正常摄食行为与神经调节的运动行为。成鱼实验结果中包括三个部分：1）在混养实验中，两种基因型斑马鱼的存活率、平均

8、体重、肝体比、脏体比均没有显著差异；WB（Westernblot）结果显示，两种基因型斑马鱼垂体中生长激素的蛋白表达量没有显著差异；全鱼总蛋白和总脂肪