USH2A基因敲除导致斑马鱼听力障碍和迟发的视网膜色素变性

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1、分类号学号D201477461学校代码10487密级博士学位论文USH2A基因敲除导致斑马鱼听力障碍和迟发的视网膜色素变性学位申请人：韩珊珊学科专业：遗传学指导教师：刘木根教授答辩日期：2018年11月14日ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinGeneticsKnockoutofUSH2AGeneinZebrafishCausesHearingImpairmentandLateOnsetRod-ConeDystrophyCandidate：Han

2、ShanshanMajor：GeneticsSupervisor：Prof.LiuMugenHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaNov,2018华中科技大学博士学位论文摘要Usher综合征（Ushersyndrome，USH）又称遗传性耳聋-视网膜色素变性综合征，以先天性耳聋和进行性的视网膜色素变性（retinitispigmentosa，RP）为主要临床特征，有时也伴有平衡觉障碍。该征的遗传方式为常染色体隐性。临床上，根据耳聋程度的不同，以及前庭功能受损情况，Usher综合征可分为USH1、USH2、USH3三

3、种亚型。USH具有广泛的遗传异质性，目前已鉴定出13个致病基因。USH2是USH最为常见的亚型，其患者占发病人口总数的50%以上，而约70%的USH2则是由于USH2A基因突变导致的。USH2A基因在1994年被定位于1号染色体长臂，1998年Eudy等首次通过定位克隆鉴定了USH2A基因。目前已被鉴定出的USH2A突变多达400多个，遍布于整个USH2A外显子和内含子区域。USH2A基因有两个转录本—isoform_a和isoform_b。Isoform_a包含21个外显子，其产物大小约170kDa；Isoform_b含有72个外显子，编码产物usherin是一个600kDa的跨膜蛋白。Is

4、oform_a即为isoform_b的前21个外显子，主要在基底膜表达。而在视网膜和内耳，isoform_b则是主要的存在形式。Usherin蛋白（USH2A）的C端位于细胞膜内，具有PDZ结合结构域（PBM）；位于胞外的巨大部分则含有多种在胞外基质蛋白中常见的结构域。目前对于USH2A突变导致USH2的病理机制尚不清楚，且没有有效治疗手段，USH2A基因敲除小鼠模型也并未阐释出USH2A在视网膜的具体功能。为进一步揭示USH2A突变导致USH2的机理，我们利用TALEN技术构建了USH2A基因敲除的斑马鱼模型并进行探究。斑马鱼USH2A蛋白与人类USH2A具有52%的序列一致性，结构域排布也

5、相似。利用USH2A敲除（USH2A-/-）斑马鱼模型，我们首先采用惊恐反射实验进行听力检测。听力测试结果显示USH2A-/-斑马鱼具有早发的、非进行性的听力下降，这种听力上的损伤是由于内耳静纤毛数量减少、形态异常导致的。听力方面的表型与USH2A敲除的小鼠及人类患者非常相似。视觉方面，幼鱼视网膜电图（ERG）检测发现USH2A敲除使得斑马鱼视力轻度损伤。视网膜组I华中科技大学博士学位论文织学检测发现，在10月龄之后，USH2A-/-斑马鱼的感光细胞开始逐渐退化，然而这种退化进行地十分缓慢，20个月时与10个月相比也并未出现明显恶化。透射电子显微镜（TEM）观察显示感光细胞的退化主要发生在外节

6、。视杆外节的退化要先于视锥退化出现，这与视网膜色素变性过程的描述是一致的。USH2A基因的功能研究方面，首先在mRNA和蛋白水平对光转导过程相关的基因进行检测，发现在斑马鱼中USH2A基因敲除并不直接影响光转导过程。然而，USH2A-/-斑马鱼感光细胞外节的退化会导致光转导蛋白的表达下调，这种下调可能是导致成年USH2A-/-斑马鱼视力退化的重要原因之一。考虑到其它研究中证实USH2A蛋白的LE结构域可与纤连蛋白相互作用，而纤连蛋白是胞外基质的一种重要成分，可维持基底膜的稳定性，因而我们探究了USH2A敲除对视网膜纤连蛋白及胞外基质是否会产生影响。利用纤连蛋白抗体对斑马鱼视网膜冰冻切片进行免疫

7、荧光标记，发现1个月时，与野生型斑马鱼相比，USH2A-/-斑马鱼视网膜基底膜纤连蛋白荧光信号即出现减弱；随着年龄增长，到10个月左右，在USH2A-/-斑马鱼中荧光信号基本消失。免疫印迹检测纤连蛋白表达，同样发现USH2A-/-斑马鱼视网膜的纤连蛋白存在下调。此外，细胞粘附分子ITGB1的表达也下调，说明细胞与胞外基质之间的粘附作用可能减弱。这些结果表明在视网膜的基底膜，USH2A可能作为结构蛋