stat1a基因crispr敲除对斑马鱼早期胚胎骨骼发育的影响研究

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1、硕士学位论文stat1a基因CRISPR敲除对斑马鱼早期胚胎骨骼发育的影响研究学科专业生理学学位类型科学学位□专业学位研究生姓名熊玖玲导师姓名、职称陈湘定教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月分类号密级学校代码10542学号201202141154stat1a基因CRISPR敲除对斑马鱼早期胚胎骨骼发育的影响研究TheeffectsstudiesofCRISPRknockoutforstat1ageneonzebrafishembryonicskeletaldevelopment研究生姓名熊玖玲指导教师姓名、职称陈湘定教授学科专业生理学研究方向生理基因组学与

2、生物信息学湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五年湖南师范大学学位论文原创性声明：所呈交的学位论文，独本人郑重声明，是本人在导师的指导下立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的巧容外，本论文不含任何其他个人或集体巴经发表或撰写过的作度成果．対本文巧研究做出重要贡献的个人和集体，均邑在文中ＬＸ明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。－学位论文作者签違：？〇化年ｔ月曰；多湖南师范大学学位论文版权使用授权书、使用学位论文的规定本学位论文作者完全了解学棱有关保留，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学

3、。同意学校保留并向固家有关部口或机构送交论文巧复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可Ｗ将本学位论文巧全部或都分巧容编入有关数据库进行拾蒙，可ｔ义采用影巧、鑑巧或担描等复制手段保存和汇编本学位论文。作者签名：Ｂｍ：ｂｎ＾Ｂ导师签名：下日期知６月？扫摘要骨质疏松表现为较低的骨密度，是一种容易导致骨折的全身性骨骼疾病，严重影响公众健康，与骨骼发育有密切关系。本研究室早期通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现STAT1基因与骨质疏松密切相关，但不清楚STAT1基因在体调控骨骼发育而导致骨表型改变的作用机制，所以本研究结合分

4、子遗传学手段，选择斑马鱼模型进行在体研究，进一步揭示骨骼发育的分子调控机制，对骨质疏松症的预防、诊断、治疗以及药物开发都有重要意义。斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且STAT1基因进化上较为保守，人类STAT1基因的两个不同剪接体STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a和stat1b，研究发现stat1a在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。本文主要通过CRISPR/Cas9基因打靶技术，在斑马鱼stat1a基因上设计合适的打靶位点，将体外合成的特异

5、性sgRNA（终浓度20ng/μL）和Cas9-mRNA（终浓度300ng/μL）显微共注射进斑马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。对F0代斑马鱼提取基因组DNA后进行T7E1酶切检测以及Sanger测序，成功筛选到2条stat1a基因突变的F0代斑马鱼。在F1代受精后20天、30天和47天，随机挑取两个突变体的F1代斑马鱼和野生型斑马鱼各10条，测量其长度，发现突变体F1代斑马鱼要比野生型生长速度更快。I结果与小鼠stat1-/-敲除研究发现骨密度与骨量增加一致，提示stat1可能通过抑制成骨细胞生成影响骨骼发育。目前，已经从F2代胚胎中鉴定到stat1a突变体

6、纯合子。用Phyre软件预测F1代突变体STAT1蛋白质空间结构时发现，其二级结构的某些保守结构域位点发生改变。STAT1蛋白的V638和S639处是同源二聚体界面，对应于F1代突变体的这两个氨基酸位点，V630和S631却不再是同源二聚体接触面。可能是由于stat1a基因突变影响STAT1同源二聚体的结合，影响骨骼的生长发育，从而导致斑马鱼生长更快。为进一步分析stat1a基因敲除后的变化，利用不同浓度STAT1抑制剂磷酸氟达拉滨（Fludarabine）处理斑马鱼胚胎10天，发现随浓度增加死亡率也随之增加。低于5μg/mL浓度组的死亡率低于10%，10μg/mL、20μg/m

7、L以及40μg/mL浓度组死亡率达到30%-40%，而50μg/mL浓度组从处理第5天开始，死亡率接近70%。从处理第3天开始，实验组斑马鱼陆续出现轻微或严重畸形，且随处理浓度增大，畸形鱼的死亡率增加，且死亡的斑马鱼绝大部分是畸形鱼。氟达拉滨可抑制STAT1表达，而STAT1抑制成骨细胞分化，出现畸形可能是由于STAT1的抑制引起破骨细胞、成骨细胞生理功能失衡而导致骨骼发育异常，最终产生骨表型的改变。关键词：stat1a，CRISPR/Cas9，骨骼，斑马鱼IIABSTRACTC