萍乡红鲫hira基因克隆、表达分析及多克隆抗体制备 (1)

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1、摘要＼删艄摘要萍乡红鲫(Pingxiangred-transparentcruciancarp，Carassiusauratusvar．Pingxiangnensis)是分布在江西省萍乡地区的天然三倍体鲫突变体，经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代，具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。Hir／Hira基因是一种组蛋白基因表达负调节因子，其产物HIR／HIRA作为组蛋白的伴侣蛋白，广泛存在于多种生物体内发挥不同的作用。HIRA蛋白家族最显著的特点是氨基酸序列N端存在7个高度同源的WD40结构域，此结构域常介导蛋白质之间的相互作用，参

2、与多种细胞功能的调节，在信号转导、蛋白运输、染色体修饰、转录或RNA加工、细胞凋亡等过程中具有重要作用。另据报道称Hira基因可能对鱼类精核解凝发挥重要作用。因此，本研究以萍乡红鲫为材料，对t-矗ra基因在三倍体鱼类中基因构成及表达特征进行了初步探索，为研究该基因在生殖发育过程中的作用打下基础。主要内容如下：1．采用SMARTcDNA合成和RACE．PCR等技术，克隆得到全长cDNA序列，长度为3851bp，包含一个3033bp的开放阅读框，编码1010个氨基酸。为提交和查阅序列方便，将此序列命名为C．auratusvar．Pingx

3、iangnensi．HIRA(简写为Cavp．HIRA)，并提交到NCBI录入GenBank中，登录号为HM067834。另外，通过生物软件分析，发现萍乡红鲫Hira基因与银鲫Hira基因在进化分类上存在较高的同源性，并且在其推导氨基酸序列N端包含7个WD40区，因而推定萍乡红鲫HIRA属于HIRA蛋白家族。2．利用荧光定量PCR技术检测了Hira基因在萍乡红鲫心、肝、脾、肾、脑、肌肉、精巢、卵巢等组织中的表达情况，结果发现该基因在卵巢中大量表达，而在其余组织中存在少量表达或是不表达的情况，与所做的RT-PCR结果基本吻合。3．在克隆

4、得到的序列开放阅读框内，选取了一段长550bp的保守结构域进行了蛋白原核表达，用亲和层析法纯化了表达产物，利用紫外吸收差法测定纯化蛋白浓度，并将其作为抗原免疫家兔，成功制备了多克隆抗体，以便用于后期免疫荧光组织化学等实验。本研究为萍乡红鲫Hira基因在鱼类遗传发育方向的研究打下基础。关键词：萍乡红鲫；Hira；WD40；三倍体鲫鱼；雌核发育：荧光定量PCRAbstractABSTRACTCarassiusauratu$var．Pingxiangnensisarenaturaltriploidcruciancarp，distributi

5、nginPingxiangregionJiangxiProvince．Weobtainedsteady’goingoffspringofhereditarycharacter,throughartificialbreeding，whosemodesofreproductionaregamogenesisandgynogenesis．Asakindofnegativeregulatorsinhistonegeneexpression，theproducionofgeneH／r／Hira--HIP．／HIRA．iswidespreadin

6、vivoandplaysdifferentroles勰histonechaperones．ThemostsignificantfeatureofHIRAproteinfamilyisthattheNterminalsequenceofaminoacidhas7highhomologousWD40structuraldomains．ThisdomainoftenCanmediateinteractionsamongproteins，involvinginVariOUSkindsofcellfunctionregulation．Andit

7、canplayanimportantroleinsignaltransduction，proteintransport，chromosomemodification,transcriptionorRNAprocessing，andcellapoptosisprocess．Inaddition，accordingtoreportsonfishsperm，Hiragenemayplayanimportantroleinthenuclearcoacervationsolution．Therefore，thisstudyinPingxiang

8、redcruciancarp，hadapreliminaryexplorationongeneticconstitutionandexpressionoftheHirageneinthetriploidfish．Itpr