萍乡红鲫卵膜糖蛋白zp3基因的克隆与表达

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1、南昌大学硕士学位论文萍乡红鲫卵膜糖蛋白ZP3基因的克隆与表达姓名：吴会芳申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：洪一江20081206摘要萍乡红鲫(Pingxiangred．transparentcruciancarp，CarassiusauratusVar．Pingxiangnensis)是在江西省萍乡地区分布的天然三倍体鲫突变体经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代，具有两性生殖和雌核发育两种生殖方式。卵透明带(zonapellucida，ZP)，是围绕在卵外周的细胞外糖蛋白基质，ZP3是ZP家族的成员之一。实验表明，ZP3是初级精子受体，在哺乳动物中己被证实

2、具有结合精子并引发顶体反应的功能，其O．连糖基化侧链在精子结合中起关键作用。本论文主要内容分为两部分：一、采用SMARTcDNA合成和RACE．PCR技术扩增萍乡红鲫ZP3基因的cDNA序列，克隆得到的cDNA序列长度为1278bp。该序列具有完整的3’端，包含终止密码子TAA，加尾信号AAT八AA以及30bp的poly(A)尾巴。其中16．1230bp为ZP3的部分开放阅读框，编码404个氨基酸残基。比较萍乡红鲫、银鲫、普通鲤鱼、彩鲫和普通鲫鱼ZP3氨基酸序列同源性，结果表面萍乡红鲫和银鲫之间的同源性最高，提示在进化中，二者的亲缘关系可能很近；二、将萍乡红鲫ZP3eD

3、NA核心片段克隆到表达载体pET．32a中，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，通过异丙基．D．D．硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，表达出ZP3融合蛋白，用Ni小汀A树脂亲和层析纯化表达产物，并通过SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS．PAGE)进行检测和鉴定，最后采用Bradford法对纯化的蛋白进行定量。结果得到较为纯化的ZP3融合蛋白，其分子大小约为31KDa，浓度为3．588mg／ml。为下一步ZP3抗体的制备以及进一步研究萍乡红鲫ZP3在卵子发生过程中的表达特征奠定基础。同时也为从精卵识别与早期结合的角度深入研究萍乡红鲫受精过程，探索鱼类受精过程中的精卵识别机制提供有价值

4、的基础资料，并为其繁殖、养殖指导生产提供理论依据。关键词：萍乡红鲫；ZP3基因克隆；表达ABSTRACTPingxiangred-transparentcmciancarp，Carassiusauratusvar．PingxiangnensisisawildnessnaturaltripledcruciancarpmutantdistributedintheareaofPingxianginJiangxiProvince．Ittakesbi．sexualandgynogeneticreproductionmodewhichissimilartothesilvercmci

5、ancarp。Carassiusauratusgibelio(B10ch)．Zonapellucida(ZP)isthemarxglycoproteinextracellulararoundtheperipheraleggs．ZP3isamemberoftheZPfamily．Experimentsshowedthat，ZP3isthereceptorofprimarysperm，anditcouldcombinespermsandleadstoacrosomereactioninmammals．Its0．．1inkedglycosylatedsidechainplay

6、sakeyroleduringspermcombination．Themaincontentofthispaperincludestwoparts．First：weclonedtheeDNAsequenceofZP3fromPingxiangred-transparentcmciancarpbyusingSMARTeDNAsynthesisandRACE．PCRmethods．Thesequenceweobtainedis1278bp．Ithascomplete3’endincludingterminalcodonTAA，atailingsignalAATAAAanda

7、tailwith30-bplongpolyA．ThepartialopenreadingframeofZP3isfrom16bpto1230bpanditencodes404aminoresidues．AnalysisofaminoacidsequencehomologyindicatedthatPingxiangred—transparentcmciancarpshowedthelligllesthomologwithsilvercmciancarp．TIlisresultssuggestedtheymighthaveveryclose