淇河鲫il-8的基因克隆与表达研究及其多克隆抗体的制备

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1、CLoNINGANDEXPRESSIONRESEARCHANDITSPoLYCLoNALANTIBoDYPREPARATIoNFRoMCARASSIUSAURATUSINQIHERIVERADissertationSubmiRedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLuoYantingSupervisor：WangJu

2、nliMay2014摘要fIIIIIIlUllllllllll[1llll[1lll[[1lllllllllllIY2550592白细胞介素一8(IL．8)是一种CXC型趋化因子，它与鱼类的先天性免疫关系密切。本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了淇河鲫(CarassiusauratusinQiheriver)／L．8的eDNA全序列，并通过构建pET-32a(+)重组载体制备了具有免疫原性的IL．8蛋白，然后免疫动物获得了兔抗淇河鲫IL．8多克隆抗体。另外，利用实时荧光定量PCR技术，检测儿．8基

3、因在健康淇河鲫不同组织的表达规律，并经腹腔注射LPS后0h、4h、8h、12h、ld、3d、7d，检测肌肉、脾脏、头肾、肠4个组织中见一8基因的相对表达量。1．淇河鲫儿．8的基因克隆及序列分析淇河鲫乜．8cDNA序列全长为641bp，其中5’非编码区102bp、3’非编码区242bp和开放阅读框297bp，共编码98个氨基酸。肽链结构中含有4个保守的半胱氨酸，前两个半胱氨酸之间被一个精氨酸隔开；第一个半胱氨酸前缺乏经典的ELR(谷氨酸．亮氨酸．精氨酸)结构；预测的空间结构含1个cL螺旋和3个D折叠；

4、淇河鲫IL一8与鲤鱼、鳙鱼、草鱼、鲢鱼等鲤科鱼类的氨基酸同源性较高。2．淇河鲫儿．8基因的组成型和诱导性表达定量PCR检测发现，淇河鲫儿．8基因在头肾、肌肉、脾脏、肝胰脏、肠、鳃、心脏、脑8个组织都有表达，肌肉中表达量最高，其次为脾脏、头肾和脑等。腹腔注射LPS对肌肉、脾脏、头肾和肠道见．8表达均有上调作用。肌肉皿一8表达量在注射后3d达到最高；脾脏乜一8表达量在4h时即达到较高水平，之后趋于稳定；肾尼．8在注射后4h即达到最大值，之后逐渐下降，3d后表达量趋于稳定；肠见一8表达量随时间点呈现先升后

5、降的趋势，12h达到最大值。生理盐水也可上调被检的4种组织皿．8的表达。3．淇河鲫IL．8的原核表达及多克隆抗体的制备选取淇河鲫IL．8不含信号肽的编码序列，引入髓搬I和HindIII限制性酶切位点，构建了pET-32a(+)．IL．8重组表达载体，在大肠杆菌Rosetta中进行了原核表达，经IPTG诱导后，获得了IL．8重组蛋白。诱导工程菌产生大量的重组IL-8蛋白并加以纯化，采用皮下多点注射的方法免疫新西兰大白兔，获得淇河鲫IL．8的抗血清，ELISA检测效T价为1：100000。关键词：淇河鲫

6、，白介素．8(IL．8)，诱导表达，原核表达，多克隆抗体AbstractIntedeukin-8(IL-8)isaCXCchemokine，whichiscloselyrelatedtoinnateimmunityoffish．Inthisstudy,CarassiusauratusinQiheriverwastheresearchobject．UsinghomologycloningandRACEtechnology,weclonedthefullsequenceofIL·8eDNA，andthe

7、immunogenicproteinofIL-8bypET-32a(+)expressionplasmidexpressing，andIL-8werepreparedpolyclonalantibody．Secondly,usingreal-timefluorescentquantitativePCRtechnology,wedetectedtheexpressionofIL一8geneindifferenttissuesofhealthycruciancarp，aswellasafterintra

8、peritonealinjectionofLPS，IL一8geneexpressionlevelswereexminedinmuscle，spleen，kidney，tissue．1．ThecloningandsequenceanalysisoflL一8incrueiancarpThefulllengthsequenceofIL一8eDNAincruciancarpis641bp，including102bp5’UTR,242bp3’UTRand297bpopenre