淇河鲫c型和g型溶菌酶基因克隆及表达分析

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1、单位代码10476学号1204180305分类号Q17舛南封祐夫I硕士学位论文淇河鲫C型和g型溶菌酶基因克隆及表达分析学科、专业：生理学研究方向：分子生理学申请学位类别：理学硕士申请人：王美娟指导教师：张红绪教授孔祥会教授二〇一五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明

2、并表示了谢意。作者签名:1足奶urn：关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名：.导师签名:GENECLONEANDEXPRESSIONANALYSISOFC-TYPEANDT-TYPELYSOZYMEINQIHECRUCIANCARPCARASSIUSAURA

3、TUSADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByWangMeijuanSupervisor:Prof.ZhangHongxuProf.KongXianghuiMay,2015II摘要淇河鲫（QihecruciancarpCarassiusauratus），具有很高的营养和经济价值。近年来，高密度、集约化的养殖模式，导致鱼类疾病暴

4、发。因此，提高免疫能力对控制鱼类疾病的发生显得尤为重要。溶菌酶（Lysozyme,Lys）是一种重要的非特异性免疫因子，它通过水解细菌细胞壁的β-1,4糖苷键而杀死细菌，对鱼类抵御外界细菌入侵具有重要作用。本研究以河南鹤壁水产养殖场的淇河鲫为研究对象，以肝脏总RNA为模板，使用RT-PCR和RACE技术克隆淇河鲫c型和g型溶菌酶cDNA全长；采用荧光定量PCR法和比浊法对淇河鲫不同组织溶菌酶的表达及酶活性进行测定；同时对经嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理后，各组织溶

5、菌酶表达变化及酶活性进行分析，为研究淇河鲫溶菌酶的免疫防御功能及分子机制奠定理论基础。基因克隆获得c型溶菌酶cDNA全长为679bp，开放阅读框为438bp，编码145个氨基酸。理论等电点为8.86，相对分子质量为1.66ku。含有两个保守的氨基酸催化位点，分别是Glu（第53位）和Asp（第69位）。八个保守的Cys，可形成四对二硫键。含有N端信号肽，为一种分泌蛋白。g型溶菌酶cDNA全长806bp，开放阅读框为564bp，编码187个氨基酸。理论等电点为9.04，相对分子质量为2.09ku。三个保守的催化位点分别是Glu（第73位）、Asp（

6、第86位）和Asp（第97位），有一个Cys残基，不形成二硫键，无N端信号肽，为胞内蛋白。同源性分析显示，淇河鲫c型溶菌酶与金鱼同源性最高，为99.3%，与其它鲤形目鱼类同源性在80%以上，但与硬骨鱼类的同源性较低，仅为40%左右。淇河鲫g型溶菌酶与鲤形目鱼类同源性为70%~80%，与其它硬骨鱼类同源性在50%~70%。系统进化树表明，c型和g型溶菌酶分别聚为两大类。c型溶菌酶中鱼类分为两个分支，鲤形目鱼类为一支，其它鱼类为一支，这与同源性分析结果一致，说明鲤形目鱼类c型溶菌酶在进化上较为独立。对于g型溶菌酶而言，进化树中鱼类聚为一大类。淇河鲫不

7、同组织溶菌酶基因表达量的检测结果显示，c型和g型溶菌酶均有表达，但二者在不同组织中基因表达量不同。c型溶菌酶在肾脏和头肾中表达量较高，分别是肝脏的188.6倍和316.7倍，但是g型溶菌酶在各组织的表达量无较大差异。淇河鲫不同组织溶菌酶活性检测显示，各组织均有溶菌酶活性，体表粘液中溶菌酶活性最高，且与其它组织呈极显著性差异（P<0.01）。III淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞菌和LPS后，对两种溶菌酶基因在不同组织的表达测定发现，c型和g型溶菌酶在肝脏中表达量增加明显，且与对照组呈极显著性差异(P<0.01)；在鳃中两种溶菌酶表达量呈先升高后降低。脾脏

8、中c型溶菌酶基因表达量升高，g型溶菌酶无明显变化。但在肾脏和头肾中g型溶菌酶表达量升高，c型溶菌酶变化甚微。对刺激后不同组织溶菌酶活性进