淇河鲫TLR5TLR22及信号通路关键基因克隆、表达分析及功能研究.pdf

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4、entoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinScienceByZhangJieSupervisor:Prof.KongXianghuiDate:May,2016I摘要鱼类作为低等脊椎动物，其特异性免疫尚不完善，非特异性免疫在鱼类对外界刺激及病原微生物侵袭的防御反应中起着至关重要的作用。Toll样受体是非特异性免疫中一类重要的模式识别受体，能特异性地识别病原相关分子模式，通过细胞内信号通路的传递，进一步引发细胞的免疫应答，在鱼类免疫中发挥重要作用。淇河鲫（Qihecruciancarp,Carassiusauratus）是河南特有的

5、天然三倍体鱼类。近年来，随着淇河鲫养殖范围扩大，养殖密度增加，鱼类免疫力下降，疾病逐渐增多，从而给渔业生产带来重大损失。因此，弄清病原菌感染后淇河鲫模式识别受体免疫应答机制，对于理解淇河鲫免疫应答和疾病防控具有重要的理论意义和应用价值。嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是淡水养殖鱼类暴发性传染病最主要的病原菌之一，常引起淇河鲫细菌性出血病，严重制约着淇河鲫养殖业健康发展。目前，淇河鲫感染嗜水气单胞菌后免疫反应的研究主要集中于生化指标测定和免疫基因表达变化，对淇河鲫模式识别受体免疫应答机制缺少系统研究。本论文以淇河鲫为研究对象，首先克隆其13种TLRs的部分片段，实时荧光定量

6、PCR检测嗜水气单胞菌攻毒后TLRs在脾脏和头肾中的表达变化，筛选出上调表达最为明显的TLR5和TLR22；然后对TLR5和TLR22及信号通路下游关键元件MyD88和TRAF6进行克隆，从而获得cDNA及基因组DNA全长序列，运用生物信息学方法进行结构预测及同源性分析；实时荧光定量PCR检测胚胎发育不同时期基因的表达变化、淇河鲫不同组织器官中的基因表达以及攻毒后各基因的表达响应。通过对基因进行原核表达，制备多克隆抗体，以研究蛋白表达；通过构建真核表达载体，转染HEK293T细胞系，检测相应分子的亚细胞定位及基因过表达后对下游NF-κB活性的调控作用。取得主要结果如下：（1）以淇河鲫脾脏cDN

7、A为模板，利用简并引物进行PCR扩增，得到13种TLRs（分别为TLR1、2、3、4、5、7、8、9、18、19、20、21和22）的部分片段。实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌攻毒后不同时间（3、6、12、24和48h）脾脏和头肾中13种TLRs的表达变化，结果显示TLR5和TLR22的表达上调最为明显，最高值分别达到了对照组的52.56倍和28.14倍，表明二者在淇河鲫防御嗜水气单胞菌感染的免