淇河鲫组蛋白h2b和hlp1的克隆、表达及抑菌分析

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1、单位代码10476学号1204180362分类号Q14舛為許筘七I硕士学位论文淇河鲫组蛋白H2B和HLP1的克隆、表达及抑菌分析学科、专业生态学研究方向分子生态学申请学位类别理学硕士申请人费威指导教师孔祥会教授二〇一五年五月獷创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所

2、做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名:.导师签名：WTHESTUDYOFCLONING,EXPRESSIONANDANALYSISOFANTIBACTERI

3、ALINCARASSIUSAURATUSOFHISTONEH2BANDHLP1ADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNornalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByFeiWeiSupervisor：Prof.KongXianghuiMay，2015摘要水产动物疾病防控一直是渔业生产关注的焦点。抗生素是细菌性疾病防控的有效药

4、物，但长时间使用，会使病原体产生耐药性。因此，筛选抗生素替代品，有效控制细菌性疾病是疾病防控的重要内容。抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子多肽，可有效杀灭细菌，避免产生耐药性，具有替代抗生素的潜在价值。本研究通过克隆淇河鲫（Carassiusauratus）组蛋白H2B基因的全长序列，并提取HLP1对应的编码区N端部分序列，对其分子特征进行分析；采用荧光定量PCR方法，对H2B组织表达及对嗜水气单胞菌的响应进行研究；对HLP1原核重组表达和人工合成HLP1的抑菌活性进行研究。基于叉尾鮰（Letalu

5、ruspunetaus）编码区保守序列设计引物。从淇河鲫鳃、肾、脾和肝中提取总RNA，通过RT-PCR技术获得cDNA第一链作为模板，扩增出淇河鲫H2B基因中间片段，将片段连接到pMD19-T载体，转化至大肠杆菌感受态DH5α中，克隆测序获得H2B中间片段长375bp。根据已获得H2B中间片段，分别设计一组用于3UTR和5UTR扩增的特异性引物，通过巢式PCR方法分别扩增出3UTR410bp和5UTR32bp的片段，拼接得到淇河鲫组蛋白H2B基因全长817bp。ORFFinder预测组蛋白

6、H2BORF长375bp，编码134个氨基酸。在线软件预测组蛋白H2B分子量为13.61kDa，等电点PI值为10.37，带有18个正电荷，为不稳定蛋白质。组蛋白H2B二级结构中含较多α螺旋和无规则卷曲，少量β折叠和延伸链。使用BioEdit分析包括亲缘关系较远的斑马纹草雀（Taeniopygiaguttata）在内的14个物种的H2B编码区序列发现，它们和淇河鲫的同源性都在75%以上，其中与斑马鱼（（Daniorerio）同源性更是高达90.7%。HLP1是组蛋白H2BN末端21个氨基酸组成的多

7、肽，含有丰富的碱性氨基酸。根据组蛋白H2B序列设计特异性引物扩增出HLP1，并成功构建重组表达质粒PET-32a-HLP1，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），筛选出阳性菌落加入到含AMP的LB培养基中培养至菌液OD600nm在0.6-0.8之间，经IPTG诱导培养后沉淀、洗涤、裂解菌体，收集裂解液，然后通过SDS-PAGE凝胶电泳，成功检测出融合蛋白。采用RT-qPCR方法检测了淇河鲫组蛋白H2B及HLP1基因在鳃、肾脏、脾脏、肝脏和头肾中的表达，正常情况下组蛋白H2BmRNA在肝脏中表达

8、量最高，肾脏和头肾次之，在鳃和脾脏中表达量较少，HLP1在头肾中表达量最高，肝脏次之，其余组织中的表达水平和H2B相似。鱼体注射嗜水气单胞菌后48h内，H2B和HLP1mRNA表达量在各组I织中明显上调。人工合成淇河鲫多肽HLP1，将HLP1以2倍浓度梯度稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL，随着HLP1浓度的升高，抑菌圈直径逐渐扩大，且25ug/mlHLP1即能达到100mg/mL氨苄的抗菌水平，说明HLP1抗菌活性很高，其在水生动物特别是鱼类