淇河鲫穿孔素基因的克隆与表达研究.pdf

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1、J11o1●·^·t210nlngandexpressionanalysisotpertorin^一·●，、·一●geneotCarassiusauratusinUiheriverADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByCaoyanchaoNutL‘Lbuoervlsor：1L1‘LMay,2014摘要穿孔素(po

2、reformingprotein，PFP)是由细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxielymphocyte，CTL)和自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)分泌的一种具有很强溶胞活性的细胞毒蛋白，PFP不仅是一种重要的免疫效应分子，还是一种免疫调节分子。由PFP介导的细胞毒作用是CTL清除病毒感染和变异细胞的主要作用机制。本研究对淇河鲫(CarassiusauratusinQiheriver)的PFP基因进行了克隆鉴定，并使用RT-PCR和Q．PCR技术检测了淇河鲫的PFP基因在不同组织中以及早期发育阶段基因的表达，使

3、用Q．PCR技术对淇河鲫在诱导剂诱导和病原胁迫下PFP基因的表达进行了分析。使用简并引物扩增获得淇河鲫的两个PFP基因的中间片段，使用RACE法扩增得到PFP基因cDNA全长。淇河鲫PFP．1基因eDNA全长为2151bp，其中，57一非翻译区(UTR)119bp和3’UTR346bp，ORF为1686bp，编码561个氨基酸。PFP．1蛋白的分子量约为63．304kDa，pI为9．07；淇河鲫PFP．2基因的eDNA序列全长为2047bp，5，_UTR177bp和3’UTR196bp，ORF为1674bp，编码557个氨基酸。PFP

4、．2蛋白的分子量约为60．997kDa，pI为9．28。结构预测显示，PFP．1和PFP．2都含有MACPF和C2等保守结构域。PFP．1还存在有一个富含丝氨酸的SER．RICH结构区域，而PFP．2则拥有一个特殊的CXCXC半胱氨酸结基序。TMHMM软件分析，PFP．1和PFP．2都没有跨膜螺旋。RT-PCR以及Q．PCR结果显示，淇河鲫PFP．1和PFP．2转录本在所取的12个组织中以及早期发育阶段均有表达，且在不同组织中，基因的表达量具有一定的差异性。PFP．1基因在肌肉中的表达量最高，而在心脏和卵巢中的表达量最低；PFP．2基

5、因在鳃中的表达量最高，而在卵巢中的表达量最低。PFP．1与PFP．2在淇河鲫的早期发育阶段的表达变化存在一定的差异。PFP．1基因的表达量从成熟的卵细胞开始到处于心跳期的受精卵，呈先降后升的趋势，在初孵仔鱼出现短暂回落之后又持续上调并稳定表达；从成熟的卵细胞、处于细胞分裂期的受精卵至胚孔封闭期，PFP．1基因的表达量持续下调并达到最低，与成熟的卵细胞相比，PFP．1基因的表达量下降约46倍，之后又呈现稳步上调的趋势；PFP．2基因的表达量从成熟的卵细胞开始到晶体出现期，呈先升后降的趋势，之后表达量持续上调至出膜第10d达到T第二个高峰

6、期，再逐渐下调并趋于稳定。PFP．2基因从成熟的卵细胞到桑葚期，表达量持续上调并达到最高，表达量约上调24倍，之后至晶体出现期，基因表达量持续下调并达到最低，与桑葚期相比，约下调125倍，之后至出膜第10d，表达量持续稳定的增加，从出膜第10d至30d，PFP．2基因表达量又略微下调并趋于稳定。在早期发育阶段，推测穿孔素在保护胚胎的正常发育以及仔鱼的非特异性免疫方面发挥着重要作用。淇河鲫经PolyI：C、PHA两种诱导物刺激后，PFP．1基因在血液和脾脏中的表达量都呈先升后降的趋势，而在头肾中的表达变化无明显规律。PHA诱导后PFP．

7、1和PFP．2基因在肝脏中的表达则呈持续下调的趋势；而经PolyI：C诱导后，PFP．1和PFP．2基因在脾脏、肝脏中的表达变化则存在很大的差异。嗜水气单胞菌急性胁迫淇河鲫6h时，PFP．1基因在肝脏、脾脏、肾脏、血液、肠道和鳃六个组织中的表达量均下调，以脾脏中的表达量下调最为显著；PFP．2基因在鳃、脾脏和肝脏中表达下调，而在肾脏、血液和肠道中则表达上调。推测两种PFP基因在机体的免疫防御中发挥着不同的作用。关键词：淇河鲫，穿孔素，基因克隆，组织表达IIABSTRACTPerforin(poreformingprotein，PFP)

8、issecretedbycytotoxicTlymphocyte(CTL)andnaturalkillercells(NK)，andotherlymphoidcells．Itisakindofcytoxicprotein