淇河鲫cuznsod和mnsod基因的克隆及其对嗜水气单胞菌的响应

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1、单位代码10476学号1204180303分类号Q17硕士学位论文淇河鲫CuZnSOD和MnSOD基因的克隆及其对嗜水气单胞菌的响应学科、专业生理学研究方向分子生理学申请学位类别理学硕士申请人乔丹张红绪教授指导教师孔祥会教授二O—五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。作者签名:BIB：

2、^>关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名：_导师签名：、♦你^曰期:THECOPPERZINCSUPEROXIDEDISMUTASEANDMANGANESESUPEROXIDEDISMUTASEFROMQIHECRUCIANCARPCARASSIUSAURATUS:MOLECULARCLON

3、ING,CHARACTERIZATIONANDRESPONSETOAEROMONASHYDROPHILAINFECTIONADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceBYQiaoDanSupervisor:Prof.ZhangHongxuProf.KongXianghuiMay,2015摘要超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）是生物抗氧化系

4、统中重要的组成部分，主要用于清除体内多余的活性氧自由基，以保护机体遗传物质的完整性、细胞膜的稳定性等。水生动物由于缺乏特异性免疫，其自身天然免疫十分重要。近年来，大量研究证实SOD参与水生动物抗氧化反应。淇河鲫（QihecruciancarpCarassiusauratus）是河南省特有珍贵水产品，拥有很高的营养价值和经济价值，因此研究淇河鲫SOD基因特征及对病原菌的表达响应对于理解SOD的生物学功能具有重要意义。本研究以淇河鲫为研究对象，以淇河鲫肌肉总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出CuZnSOD和MnSOD的cDNA全长序列；采用qPCR技术分别检测了CuZnSOD和

5、MnSOD在健康淇河鲫10种器官组织中的表达情况；探究嗜水气单胞菌和LPS分别处理后淇河鲫肝、鳃、肾、脾和头肾中的表达响应；同时，采用羟胺法测定了相应酶活性变化。这些研究对于理解鱼体的抗氧化防护机制有重要意义，并为淇河鲫疾病防控提供理论依据。基于已知序列，设计引物，分别扩增淇河鲫CuZnSOD和MnSOD的中间保守序列、3’端和5’端序列，经拼接后分别获得759bp和960bp两条cDNA全长序列。淇河鲫CuZnSOD的开放阅读框(ORF)长465bp,编码154个氨基酸。预测淇河鲫CuZnSOD的分子质量为16.11KD，理论等电点为5.95。活性中心中，Cu2+结合位点为：H

6、is-47、-49,-64、-121，Zn2+结合位点为：His-64、-72、-81、Asp-84。两个CuZnSOD的家族标签序列：45GFHVHAFGDNT55、139GNAGGRLACGVI150。两个糖基化位点：N16、N69。此外，两个半胱氨酸C58和C147形成一个二硫键。且淇河鲫CuZnSOD无跨膜区与信号肽，是一种胞质CuZnSOD。淇河鲫MnSOD的ORF框共675bp，编码224个氨基酸。预测其分子质量为24.87KD，理论等电点为8.28。活性中心的Mn2+结合位点为：His-52、-100、Asp-185、His-189。一个MnSOD的家族标签序列：1

7、85DVWEHAYY192。在序列前端有26bp的线粒体靶向序列(MitochondrialTargetingSequence,MTS)：1MLCRVGYVRRCAATLNPILGAVASKQ26。分别将两个基因的氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对，发现它们在不同物种中都有很强的保守性。构建系统进化树发现，淇I河鲫CuZnSOD聚于鱼类胞质CuZnSOD的分支中，而淇河鲫MnSOD聚于鱼类线粒体MnSOD的分支中。采用qPCR技术检测淇河鲫鱼10种器官组织（肝、心、肌肉、脾