耻垢分枝杆菌glmu基因克隆、 表达及多克隆抗体的制备

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1、耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备：张文利,申慧,辛毅,马郁芳【摘要】　　目的:制备抗耻垢分枝杆菌（Smeg）GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29bSmegglmU,用IPTG诱导表达,经NiNTAAgarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗SmegGlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以D18T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司;E.coliNovaBlue菌株、

2、E.coliBL21(DE3)菌株和pET29b表达载体购自美国Novagen公司;耻垢分枝杆菌mc2155菌株购自ATCC公司。　　1.2方法　　1.2.1目的基因glmU获取及其克隆的构建在TIGR网站(.tigr.org/tdb/)数据库中,获取mc2155菌株glmU基因的核苷酸序列(1449bp)。根据获得的基因序列设计PCR引物,分别为:上游引物glmUF:5′CATATGACCGCATCAACCGAGGCCGCG3′,其中具有下划线的序列为NdeI酶位点;下游引物glmUR:5′C

3、TCGAGGCTCTCGTCGCCCAACGCCTTG3′,下划线的序列为XhoI酶位点。以mc2155基因组DNA为模版,glmUF和glmUR为引物,用LATaqDNA聚合酶进行PCR反应扩增目的基因SmegglmU,回收、纯化PCR产物,并将其克隆进pMD18T载体产生克隆质粒pMD18SmegglmU,并将其转化入E.coliNovaBlue细胞中进行扩增。提取质粒pMD18SmegglmU,应用NdeI/XhoI双酶质粒DNA鉴定重组质粒,选取其中被鉴定正确的pMD18Smeggl

4、mU送至日本宝生物工程（大连）有限公司,用RVM和M1347测序引物对重组质粒中的SmegglmU基因进行序列测定。将DNA测序结果与mc2155glmU基因序列进行比对,确定所克隆的glmU基因序列的正确性。　　1.2.2表达载体pET29bSmegglmU的构建应用NdeI/XhoI将pMD18SmegglmU上的SmegglmU切割下来,并亚克隆进经过同样NdeI/XhoI双酶作用的载体pET29b上,产生pET29bSmegglmU。提取重组质粒DNA,并分别用NdeI/XhoI双酶切及

5、SmaI单酶切两个反应来鉴定pET29bSmegglmU重组质粒。　　1.2.3GlmU蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达将pET29bSmegglmU重组质粒转化入BL21(DE3)宿主细胞中进行诱导表达。在LB琼脂培养基/Kan上挑取菌落并接种到3mLLB/Kan液体培养基中,在37℃振荡培养16h。次日将培养菌接种到50mLLB/Kan液体培养基中,在37℃振荡培养3h,使其A600为0.4-0.6,加入IPTG,使其终浓度达到1mmol/L,继续在37℃振荡培养3h,以诱导GlmU

6、重组蛋白表达。　　1.2.4GlmU纯化与鉴定收获经诱导表达的BL21(DE3)细胞,用5mL含1mmol/LPMSF的preplysisbuffer（20mmol/LTrisHCl,0.5mol/LNaCl,20%Glycerol,pH8.0）重悬细菌并置于冰上,超声破碎细胞(工作60s,间歇90s,3个循环),在4℃20000g离心30min,分别取上清和沉淀。参照QIAGEN公司操作说明,用NiNTA亲和层析柱纯化上清中的蛋白质,收集洗脱液组分。将上清和沉淀组分的样品,以及洗脱液组分进行凝胶浓度

7、为150g/L的SDSPAGE分析后,将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用抗多聚组氨酸的单克隆抗体对膜进行孵育,之后用偶联有碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG抗体孵育,并用5溴4氯3吲哚磷酸(BCIP)/氮蓝四唑(NBT)显色液显色。　　1.2.5抗GlmU多克隆抗体的制备将经亲和层析纯化获得的GlmU蛋白质溶液用超滤法进行浓缩、脱盐处理并稀释后,与等体积的弗氏不完全佐剂混合,进行免疫注射雌性非孕BALB/c小鼠。经背部皮下多点(6-10个点)注射乳化抗原,共免疫3次,每隔2周加强免疫注射1次,于末次免疫

8、后2周经腹腔内注射抗原（不进行乳化）1次,1周后采用摘眼球法采集血液,分离血清并保存在-20℃。　　1.2.6抗血清的特异性鉴定及效价的确定50mL的mc2155菌液生长至饱和期,离心收获细菌,用超声方法破碎细菌（工作60s,间歇90s,8个循环）后,在4℃离心（20000g）20min,收集上清,用考马斯亮蓝测定上清中总蛋白浓度,将上清液稀释2倍、4倍、8倍后,进行150g/L的SDSPAGE分析,电泳完毕后将其从凝胶转移