迟钝爱德华氏菌 eseB 抗体制备及免疫检测方法的建立-论文.pdf

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1、第33卷第6期球科学V0I_33No．62014年6月FISHERIESSCIENCEJun．2O14迟钝爱德华氏菌eseB抗体制备及免疫检测方法的建立李军伟，高皤，王斌(大连海洋大学辽宁省高校海洋生物资源可持续利用重点实验室，辽宁大连116023)摘要：以重组的eseB蛋白为抗原，通过免疫新西兰兔获得了高效价的免疫血清，并建立快速检测迟钝爱德华氏菌的间接ELISA方法。结果显示，用重组eseB蛋白免疫新西兰兔后，ELISA检测血清效价为1：512000；Westernblot检测重组eseB蛋白与多克隆抗体有良好的特异性；通过E

2、LISA检测确定迟钝爱德华氏菌抗原的最佳包被密度为1O。个／mL，多克隆抗血清的最佳稀释度为1：16000，确定其检测迟钝爱德华氏菌的最佳灵敏度为1O个／mL)对不同来源迟钝爱德华氏菌eseB蛋白进行检测，弱毒株15947和ETV与抗血清反应结果为阴性，提示eseB蛋白的表达与其致病性相关，该方法具有较高的特异性。关键词：重组eseB蛋白；迟钝爱德华氏菌；间接ELlSA中图分类号：S917文献标识码：A文章编号：1003一ll11(20l4)06—0369—05迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是多种分析、分子致

3、病机理的深入研究以及今后临床检测海水养殖鱼类的主要致病菌n。]，其引发的海水鱼迟钝爱德华氏菌毒株提供新的检测方法。出血性败血症、腹水病可造成巨大经济损失，目前1材料与方法尚无有效的预防手段。吴淑勤等[4用免疫标记技术对感染迟钝爱德华氏菌的鳗鲡进行检测。熊清1．1试验材料与试剂明等【5]通过Dot—ELISA方法检测迟钝爱德华氏菌，菌株：迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统eseB蛋白成功构建了检验该菌的试剂盒。金晓航等[6通过表达菌株BL21(DE3)由本实验室前期构建并保存。免疫组化方法建立了迟钝爱德华氏菌的检验方法，L-49231、12

4、1220和121221(大菱鲆)、080310、并且对菌体进行了定位。实践证明，免疫学方法已080313和080314(鳗鲡)由本实验室自行分离，并经在水产动物检测中得到广泛推广[7]。本实验室经过鉴定。15947与ETV(人)由大连医科大学保存的迟钝爱德华氏菌L-4923l菌株为分离自患赠送。出血性败血症大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的试验动物为成年的雄性新西兰兔，体质量约2强毒株，前期研究证实该菌株含有Ⅲ型分泌系统全kg，购于大连医科大学实验动物中心。酶标抗体购部基因片段[9]，其中效应蛋白基因与其致病力密切

5、自sigma公司，工作浓度为l：2000。相关，王斌等n叩对迟钝爱德华氏菌L一49231菌株Ⅲ1．2重组eseB蛋白的表达型分泌系统效应蛋白功能域进行过预测，认为符合挑取单个重组表达菌BL21(DE3)放人含卡那分泌系统特征。为深人研究迟钝爱德华氏菌Ⅲ型霉素的液体胰蛋白胨培养基中，37℃，220r／min，分泌系统效应蛋白的表达情况以及在菌体细胞的震荡培养过夜。取100L过夜培养液接种到含卡分布状况，笔者采用效应蛋白eseB重组表达菌株那霉素的6mL新鲜的液体胰蛋白胨培养基中，BL21(DE3)，分离提取重组表达的eseB蛋白用于

6、37℃，220r／min，震荡培养至A。。为0．4～0．6，在制备免疫血清，获得多克隆抗体用于建立ELISA培养基中加入异丙基一f}_硫代吡喃半乳糖苷至终检测方法，为效应蛋白分子在菌体细胞表面的定位浓度1．0mmol／L，37℃，220r／min，震荡培养1h。收稿日期：2013-12—09；修回日期：2014一Ol一2I．基金项目：辽宁省科技计划项目(2011203005)．作者简介：李军伟(I986一)，男，硕士研究生；研究方向：水产动物医学．E-mail：412123051@qq．corn．通讯作者：王斌(1962一)，女，

7、教授，硕士生导师；研究方向：水产动物病原免疫．E-mail：wangbin@dlou．edu．cn．水产科学第33卷将震荡培养好的菌液lO000r／rain离心1．5间接酶联免疫吸附试验方法的建立10min，收集菌体沉淀，用磷酸盐洗涤菌体沉淀后，1．5．1eseB重组蛋白抗体检测L一49231菌株弃上清液，菌体沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，然后进(1)包被抗原：用灭菌生理盐水洗脱L一49231行超声波破碎，每次5S，间隔10S，功率为100W，斜面培养物，然后用0．05mol／L碳酸盐缓冲液(pH直至溶液变透明为止。10000r／rai

8、n离心5min，分9．6)调密度至1O。个／mL作为包被抗原，分别加入别收集上清液与沉淀，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电酶标板内，每孑L100L，4℃封闭过夜。磷酸盐吐泳检测。温缓冲液(含0．05Tween20)洗涤3次，每次静置将收集的上清液与沉淀