伏马菌素B_1单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2012年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1735～1739伏马菌素B单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立许杨邹龙刘师文刘京陈波(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，南昌330047)(江西省疾病预防控制中心，南昌330029)摘要制备了高亲和力的伏马菌素B。(FB。)单克隆抗体，进而建立了谷物中FB的直接竞争化学发光酶联免疫检测方法(de—CLEIA)。采用碳化二亚胺法成功合成了FB人工抗原，经杂交瘤技术获得分泌FB，特异性抗体的细胞株，高碘酸钠法酶标单克

2、隆抗体后，建立了FB的dc-CLEIA，本方法的IC。值为1．43g／L，线性范围为0．32~8．40g／L，检出限为0．13g／L，竞争反应时间仅需20min。玉米样品加标回收率为100．2％～115．4％，相对标准偏差小于8．7％，谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化ELISA试剂盒检测结果相符。关键词伏马菌素B；单克隆抗体；化学发光酶联免疫分析；谷物1引言伏马菌素主要是由镰刀菌属产生的一类结构类似的真菌毒素，常污染玉米等谷物，其中伏马菌素B，(FumonisinB，FB。)是主要组成成分，也是毒性最强的成分]。伏马菌素不仅能引起马脑白质软化症、猪肺水肿综合症和大鼠肝癌，

3、而且与人类食管癌和肝癌的发生有关，国际癌症研究中心已将伏马菌素列为2B类致癌物质】。欧盟规定人食用玉米中伏马菌素的限量为1mg／kgt。目前，用于谷物及其制品中伏马菌素的检测方法主要有仪器分析(高效液相色谱、质谱分析等)。]和免疫学检测法删。基于抗原抗体反应建立的免疫学检测法具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强等优点，能实现高通量样品的同时快速检测。免疫学检测法的灵敏度在很大程度上取决于特异性抗体的亲和力和检测信号的放大倍数，而对于真菌毒素等半抗原，获得高亲和力抗体的关键取决于合成的全抗原的质量。化学发光反应信号放大可以提高免疫分析法灵敏度，化学发光免疫分析技术已广泛用于生物化学分

4、析、临床诊断和环境监测“”】。本实验采用简便的碳化二亚胺法成功合成了FB人工抗原，并制备了高亲和力和特异性的FB。单克隆抗体，进而建立了谷物中FB，的直接竞争化学发光酶联免疫检测法(Directcompetitivechemilumi—nescenceenzymeimmunoassay,dc-CLEIA)。本方法灵敏度高，检测时间短，有望用于开发适用于谷物中FB常规检测的商业化试剂盒。2实验部分2．1仪器和试剂伏马菌素B。酶联免疫测定试剂盒(天津生物芯片技术有限责任公司)；96孔可拆化学发光板／酶标板(深圳金灿华实业有限公司)；小鼠抗体分型试剂盒(Hycultbiotechnolo

5、gy；Waters公司)；ThermoMK3酶标仪、化学发光仪(Thermo公司)。伏马菌素B。、伏马菌素B、黄曲霉毒素B。(AFB)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)、辣根过氧化物酶(HRP)、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、匙孔血蓝蛋白(KLH)、弗氏完全佐剂和不完全佐剂，均购自Sigma公司；卵清白蛋白(OVA)、碳化亚二胺盐酸盐(EDc·HCI)，均购自上海生工生物工程公司；其它试剂纯度均为国产分析纯。2012-02-29收稿；2012—06-04接受本文系国家“863”计划资助项目(No．2007AA10Z427)*E-mail：z

6、oulong312@126．tom分析化学第40卷BALB~小鼠(雌性，4～6周龄)购自南昌大学医学院实验动物科学部。2．2人工抗原的合成采用碳化二亚胺法合成人工抗原，参考文献[10]并做适当修改，具体如下：1mgFB。溶解于1mLPBS(0．01mol／L，pH7．4)中，5mg血蓝蛋白(KLH)溶解于1mLPBS中，两者混匀后加入0．2mL10g／L新鲜配制的EDC溶液；在室温下缓慢搅拌反应2h，静置30min；在4℃于PBS中透析后，一20℃冻存备用，即为免疫抗原(FB一KLH)。检测抗原(FB。一OVA)合成方法同上，以OVA替换KLH。2．3单克隆抗体的制备将免疫抗原按5

7、0g／只的剂量与等体积弗氏佐剂充分乳化后腹部皮下多点注射免疫4只6～8周龄雌性BALB~小鼠，免疫后第7～10d，尾静脉采血，间接ELISA检测血清效价。杂交瘤技术和腹水制备参考文献[151，将免疫效果较好的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2／0通过PEG介导融合，间接ELISA筛选阳性克隆；阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株，细胞株扩大培养后，接种经降植烷致敏的BALB~小鼠腹腔内诱导生产单克隆抗体。Hycultbiotechnology小鼠抗体分型试