迟钝爱德华氏菌 eseB 抗体制备及免疫检测方法的建立.pdf

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1、第３３卷第６期水产科学Vol．３３No．６２０１４年６月FISHERIESSCIENCEJun．２０１４迟钝爱德华氏菌eseB抗体制备及免疫检测方法的建立李军伟，高璠，王斌（大连海洋大学辽宁省高校海洋生物资源可持续利用重点实验室，辽宁大连１１６０２３）摘要：以重组的eseB蛋白为抗原，通过免疫新西兰兔获得了高效价的免疫血清，并建立快速检测迟钝爱德华氏菌的间接ELISA方法。结果显示，用重组eseB蛋白免疫新西兰兔后，ELISA检测血清效价为１∶５１２０００；Westernblot检测重组eseB蛋白与多克隆抗体有良好的特异性；通过ELISA检测确８定迟钝爱德华氏菌抗原的最佳

2、包被密度为１０个／mL，多克隆抗血清的最佳稀释度为１∶１６０００，确定其４检测迟钝爱德华氏菌的最佳灵敏度为１０个／mL；对不同来源迟钝爱德华氏菌eseB蛋白进行检测，弱毒株１５９４７和ETV与抗血清反应结果为阴性，提示eseB蛋白的表达与其致病性相关，该方法具有较高的特异性。关键词：重组eseB蛋白；迟钝爱德华氏菌；间接ELISA中图分类号：S９１７文献标识码：A文章编号：１００３‐１１１１（２０１４）０６‐０３６９‐０５迟钝爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）是多种分析、分子致病机理的深入研究以及今后临床检测［１‐３］海水养殖鱼类的主要致病菌，其引发的海水鱼迟

3、钝爱德华氏菌毒株提供新的检测方法。出血性败血症、腹水病可造成巨大经济损失，目前［４］１材料与方法尚无有效的预防手段。吴淑勤等用免疫标记技术对感染迟钝爱德华氏菌的鳗鲡进行检测。熊清１．１试验材料与试剂［５］明等通过Dot‐ELISA方法检测迟钝爱德华氏菌，菌株：迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统eseB蛋白［６］成功构建了检验该菌的试剂盒。金晓航等通过表达菌株BL２１（DE３）由本实验室前期构建并保存。免疫组化方法建立了迟钝爱德华氏菌的检验方法，L‐４９２３１、１２１２２０和１２１２２１（大菱鲆）、０８０３１０、并且对菌体进行了定位。实践证明，免疫学方法已０８０３１３和０８０３１４（

4、鳗鲡）由本实验室自行分离，并［７‐８］经在水产动物检测中得到广泛推广。本实验室经过鉴定。１５９４７与ETV（人）由大连医科大学保存的迟钝爱德华氏菌L‐４９２３１菌株为分离自患赠送。出血性败血症大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的试验动物为成年的雄性新西兰兔，体质量约２强毒株，前期研究证实该菌株含有Ⅲ型分泌系统全kg，购于大连医科大学实验动物中心。酶标抗体购［９］部基因片段，其中效应蛋白基因与其致病力密切自sigma公司，工作浓度为１∶２０００。［１０］相关，王斌等对迟钝爱德华氏菌L‐４９２３１菌株Ⅲ１．２重组eseB蛋白的表达型分泌系统效应蛋白功能域进行过预测

5、，认为符合挑取单个重组表达菌BL２１（DE３）放入含卡那分泌系统特征。为深入研究迟钝爱德华氏菌Ⅲ型霉素的液体胰蛋白胨培养基中，３７℃，２２０r／min，分泌系统效应蛋白的表达情况以及在菌体细胞的震荡培养过夜。取１００μL过夜培养液接种到含卡分布状况，笔者采用效应蛋白eseB重组表达菌株那霉素的６mL新鲜的液体胰蛋白胨培养基中，BL２１（DE３），分离提取重组表达的eseB蛋白用于３７℃，２２０r／min，震荡培养至A６００为０．４～０．６，在制备免疫血清，获得多克隆抗体用于建立ELISA培养基中加入异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷至终检测方法，为效应蛋白分子在菌体细胞表面的

6、定位浓度１．０mmol／L，３７℃，２２０r／min，震荡培养１h。收稿日期：２０１３‐１２‐０９；修回日期：２０１４‐０１‐２１．基金项目：辽宁省科技计划项目（２０１１２０３００５）．作者简介：李军伟（１９８６－），男，硕士研究生；研究方向：水产动物医学．E‐mail：４１２１２３０５１＠qq．com．通讯作者：王斌（１９６２－），女，教授，硕士生导师；研究方向：水产动物病原免疫．E‐mail：wangbin＠dlou．edu．cn．３７０水产科学第３３卷将震荡培养好的菌液１００００r／min离心１．５间接酶联免疫吸附试验方法的建立１０min，收集菌体沉淀，用磷酸盐洗涤菌

7、体沉淀后，１．５．１eseB重组蛋白抗体检测L‐４９２３１菌株弃上清液，菌体沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，然后进（１）包被抗原：用灭菌生理盐水洗脱L‐４９２３１行超声波破碎，每次５s，间隔１０s，功率为１００W，斜面培养物，然后用０．０５mol／L碳酸盐缓冲液（pH直至溶液变透明为止。１００００r／min离心５min，分９９．６）调密度至１０个／mL作为包被抗原，分别加入别收集上清液与沉淀，进行SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电酶标板内，每孔１００μL，４℃封闭过夜。磷酸盐吐泳检测。温缓冲液（含０．０５％Tween２０）洗涤３次，