石杉碱甲多克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立.pdf

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1、时珍国医国药2012年第23卷第10期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2012VOL．23NO．10酶相hT关I?R蛋T白‘-~-／c：誓笔墨蓉加O宁6．：杞多糖抗她l癌作用及对vEGF辇：■,~=J==篓箜慧苎催J]禁；006,27(。2t)JIT：lsgBo'[．⋯肿限瘤酶细胞，都存有于端登粒酶璧活性性表达。事答，。9％．[4]，糖的免疫性[J]．中国药理与，而正常细胞或组织中几乎没有检测到毒学杂志，200l；5(3)：180．fUlm和,2008：247‘

2、志物。以竖‘’．[8]v彭er林sit辉yoLBP是从宁夏传统中药枸杞子中提取的，张柏．吴孟超．端粒酶与肝癌[J]．国外医学．肿瘤学分一种水溶性多糖。：：?：：‘：：石杉碱甲多克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立余宇燕，滕海英，张红艳，林舒，邹艳辉(福建中医药大学药学院药学院，福建福州350108)捅要：目的制备珍稀药源植物蛇足石杉的活性成分石杉碱甲(huperzineA，HupA)的人工抗原及多克隆抗体，建立快速检测HupA的酶联免疫分析方法。方法采用戊二醛法，将半抗原HupA与载体牛血清白蛋白(BSA)及

3、卵清蛋白(OVA)偶联制备人工抗原HupA—BSA和包被抗原HupA—OVA。用HupA—BSA免疫新西兰大白兔，制备抗HupA的抗血清，通过间接ELISA法和竞争ELISA法检测抗血清的效价和特异性。采用ProteinA亲和层析法对抗血清进行纯化，以纯化后的多克隆抗体建立HupA的标准竞争抑制曲线。结果合成的人工抗原HupA—BSA的偶联比为10．8：1，免疫兔子得到抗HupA的抗血清，其效价为1：64000，HupA的标准竞争抑制曲线为Y=0．2151X一0．0955(R=0．9873)。结论成功合成石杉碱

4、甲人工抗原，经过免疫兔子制备抗石杉碱甲的多克隆抗体，建立HupA的酶联免疫检测方法。关键词：石杉碱甲；人工抗原；多克隆抗体；酶联免疫检测D0I标识：doi：10．3969／i．issn．1008-0805．2012．10．025中图分类号：R283文献标识码：B文章编号：1008-0805(2012)10．2440-03石杉碱甲主要来源于中国石杉科石杉属和马尾杉属植物究证实，石杉碱甲对血管性痴呆(VD)、智力低下、精神分裂中⋯，是一种新型石松类天然生物碱，作为第2代乙酰胆碱酯酶症、重症肌无力等患者有一定的治疗作

5、用。(ACHE)抑制剂，具有高效、高选择性、可逆性等特点(其分子结构见图1)。目前石杉碱甲主要用于阿尔兹海默病(AD)的治疗，可显著改善记忆功能损伤和行为与心境障碍。国内外学者研收稿日期：2012-03-24；修订日期：2012-07-23o基金项目：福建省科技厅重点项目(No．2011Y0035)作者简介：余宇燕(1973-)，女(汉族)，福建建阳人，现任福建中医药大学图1石杉碱甲分子结构药学院副教授，博士学位，主要从事药物分析的新技术新方法研究工作．·2440·LISHIZHENMEDICINEANDMAT

6、ERIAMEDICARESEARCH2012VOL．23NO．10时珍国医国药2012年第23卷第10期空白孔调零，测定各孔的OD。阴性对照用免疫前的兔子血石杉属植物以HupA作为药用成分的定量指标，目前最常用清，空白对照为PBS。每一稀释比的供试品设置3个平行。的检测方法有：薄层扫描法、高效液相色谱法等]，但存在仪器2．4．2竞争ELISA测抗血清特异性选取效价较高的兔子血清设备要求高和样品前处理复杂，不适合用于批量样品的快速筛选进行测定，用甲醇将HupA完全溶解后用PBST稀释为5×10～，5和检测。而免疫

7、分析法具有简单、灵敏度高、特异性强等优点，近×10～，0．5，l，5，50，500g／ml的系列浓度。酶标板经包被抗年来在药物有效成分的分析上有很快的发展。宋建武等利用原包被且封闭后，加入不同浓度的HupA溶液及最佳稀释倍数的戊二醛法偶联合成HupA人工抗原，制备得到HupA的单克隆抗抗体各50I，混匀后于37℃孵育lh，其余步骤同间接ELISA体，但只进行免疫原性分析，并未建立酶联免疫检测方法。本实法。根据OD。得变化判断是否发生竞争抑制。验改进HupA人工抗原的合成方法，免疫新西兰大白兔，制备2．5抗血清的

8、纯化ProteinA亲和层析法纯化抗血清：将一定量HupA多克隆抗体，建立了检测HupA的酶联免疫检测方法。的SepharoseProteinA装人层析柱中，用0．1mol／LpH7．2PBS平1材料与仪器衡，1～2ml／min；平衡完成后，将0．45Ixm滤膜过滤的抗血清以11．1材料与试剂新西兰大白兔2只(雌性，适龄，健壮，无感染m]／min流速经过层析柱，收集流穿液；用数个柱体积