粪肠球菌酶联免疫检测方法的建立

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1、摘要随着经济的发展和海洋资源的开发利用，海洋环境问题越来越严重，日益受到人们的关注。人类生产生活产生的废物，以及海洋环境中有机污染物的不断增加，导致越来越多的病原微生物进入海洋，分布于海水、生物体以及沉积物当中，致使细菌、病毒、寄生虫等成为对海洋生态系统及人体健康造成危害的重要源头。高集约化的水产养殖致使大量的病毒、细菌等致病微生物在水中滋生，海洋环境逐渐恶化和海水养殖的规模化发展导致水产养殖病害的大面积发生，该问题已成为制约世界海水养殖业继续健康发展的主要因子之一。为了提高沿岸生态系统的健康指数，需要有预测、监测、检测环境

2、污染对海洋野生生物、养殖生物和人类影响的敏感而准确的手段。随着现代生物检测技术的不断进步，基因芯片技术、DNA探针技术、PCR技术、抗体检测技术、生物传感器等，已广泛应用于海洋病原生物的监测、检测。在我国，对海洋病原微生物的监测、检测一直沿用传统的检测手段，缺少系统、快速的检测方法，难以开展常规监测，因此建立系统、特异、简便、快速、准确的海洋病原微生物检测方法十分必要。本课题为《海洋环境中病原微生物的分子快速检测与评价技术》，主要研究内容是研发用于海洋环境(海水及水产品)中病毒、致病菌等病原微生物，重点针对可能引起人类疾病的

3、快速检测的分子生物技术，为研制用于这些微生物的现场监测手段和设备奠定理论和技术基础。检测方法拟采用基因芯片检测、蛋白质检测和聚合酶链式反应(PCR)检测三种。本论文针对课题研究内容的一部分，研究开发能够引起人类疾病的病原微生物的蛋白质水平检测技术，重点是可能引起人类疾病的且在海洋环境污染指示中具有重要价值的肠球菌酶联免疫(ELISA)方法的建立。以1×1010个／mE的灭活粪肠球菌菌体悬液为抗原自行制备了粪肠球菌的多克隆抗血清，抗血清效价达到1：2048000。与其他菌的交叉反应效价均较低，具有很高的灵敏度和特异性。本文建立

4、了以菌体为包被抗原的间接酶联免疫检测方法，抗血清最适稀释度为12800倍，最低检测限达到1．Sxl03CFU／mL左右。同时用超声波震荡提取了的菌体外膜蛋白，蛋白经Bradford法测定浓度为0．5mg／mL，经westernblotting看出提取的蛋白中含有大量的菌体外膜蛋白。以此外膜蛋白为包被抗原，I摘要建立了竞争酶联免疫检测方法，最低检测限为7ng／mL左右。两种方法前者适用于浓度较高菌体的检验，而后者可通过菌体破碎检测较低浓度的菌体。，关键词：海洋病原微生物ELISA粪肠球菌ⅡAbstractAlongwithec

5、onomicdevelopmentandMarineResourceExploitation,marineenvironmentalproblemshavebecomesignificantlyserious．HumanproducedlotsofWastesinproductionanddailylife．alltheseleadtheincreaseoforganicpollutants．Meanwhile，pathogenicmicroorganismsenteredintomarineenvironments，dis

6、tributedinwater,organismsandsediments．Bacteria,virusesandparasiteshavebeentheoriginofmarineecosystemandhuman’Shealththreats．Highlyintensiveaquaculturesmakebacteriaandvirusespropagate，inadditiontOmarineenvironmentdeterioration，aquaculturediseasesbrokeuniversally．Ith

7、asbeenoneofthemaiorlimitingfactorsinaquaculturedevelopmentintheworld．Inordertopromotecoastalecosystem，thereshouldbemethodspredictingandmonitotinginfluencesonhumanwildandculturalorganismsandhumanwhichmarinepollutionproduced．Asthebiologicaldeterminingtechnologydevelo

8、ped，genechips，DNAprobes,PCRantibodiesandbiosensorshasbeenutilizedinmarinepathogenicdeterminationandmonitor．InChina,conventionalmethodshavebeenuse