饲用微生物制剂中粪肠球菌的检测方法

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1、ICS 65.120     B46     DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXX—XXXX     饲用微生物制剂中粪肠球菌的检测方法MethodfordetectionofEnterococcusfaecalisinfeedingmicrobialpreparations          XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省质量技术监督局    发布DB21/XXXXX—XXXX前  言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由辽宁省畜牧兽

2、医局提出并归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：李欣南、武凤娇、韩镌竹、高铎、田晓玲。6DB21/XXXXX—XXXX饲用微生物制剂中粪肠球菌的检测方法1　范围本标准规定了饲用微生物制剂中粪肠球菌的检验方法。本标准适用于含有益微生物粪肠球菌的各种饲料添加剂中粪肠球菌的检测和计数。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.2食品安全国家

3、标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14699.1饲料采样GB19489实验室生物安全通用要求GB/T20195动物饲料试样的制备3　稀释液、培养基及试剂实验用水的电导率在25℃时不应超过25μS/cm(相当于电阻率≥0.4ΜΩcm)，除非另有规定要求。水的微生物污染不超过103CFU/mL。应按GB4789.2执行，采用平板计数琼脂培养基，在36℃±1℃培养48h±2h进行定期检查微生物污染。3.1　0.85%灭菌生理盐

4、水。3.2　粪肠球菌琼脂培养基：见附录A中A.1。3.3　哥伦比亚血琼脂培养基：见附录A中A.2。3.4　革兰氏染色液：见附录A中A.3。3.5　革兰氏阳性菌鉴定卡或生化鉴定试剂。3.6　PCR鉴定试剂盒。4　标准菌株粪肠球菌ATCC29212。5　设备和玻璃器皿5.1　恒温培养箱：精度36℃±1℃。5.2　高压灭菌锅：使用温度为121℃。6DB21/XXXXX—XXXX1.1　微生物鉴定仪。1.2　涡旋仪：0r～2500r/min。1.3　麦氏比浊仪：量程0MCF～5MCF。1.4　显微镜：放大倍数400以上。1.5

5、　无菌采样袋/瓶。1.6　天平：0.00g～410.00g。1.7　冰箱：2℃～8℃。1.8　离心管：装量为50mL。1.9　玻璃或塑料平皿：直径为90mm。1.10　L形玻璃或塑料涂布棒。1.11　吸管或移液器：容量为0.1mL、1mL、10mL。1.12　广口瓶或三角瓶：容量为500mL。2　采样实验室样品具有真实性和代表性。采样人应佩带无菌手套和口罩。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应为无菌器皿。样品采集后置于2℃～8℃环境内冷藏保存。采样数量和方式按GB/T14699.1执行。3　试样的制备

6、按GB/T20195执行。4　操作步骤4.1　检样制备及稀释在超净工作台中称取试样25g（mL），加入盛有225mL0.85%灭菌生理盐水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）。置振荡器上，振荡30min。经充分振摇后，采用0.85%灭菌生理盐水进行1:10的稀释。用灭菌吸管吸取1:10的均匀稀释液1mL，置于灭菌的9mL0.85%灭菌生理盐水离心管中，密封，涡旋仪涡旋10s，经充分混匀后制成1:100的稀释液。根据样品含菌量，按上述稀释次序递次稀释至相应要求的稀释倍数。4.2　接种和培养选择2个或者3个适宜的稀释度，

7、用灭菌吸管分别吸取0.1mL，接种到粪肠球菌琼脂平皿（3.2）上，每个浓度接种两个平皿，使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面。涂布棒不得接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。涂布好的平皿盖上平皿盖后，室温放置15min，使接种物完全被培养基吸收为止。翻转上述平皿置36℃±1℃恒温培养箱（4.1）中培养48h±1h。6DB21/XXXXX—XXXX1.1　菌落计数及筛选培养后，选取典型菌落数在30个～300个之间的平板计数。典型粪肠球菌菌落呈圆形，表面光滑、隆起，菌落呈黑色或淡黑色，直径在0.5mm～2.0

8、mm大小的菌落。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。1.2　鉴定试验1.2.1　菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于哥伦比亚血琼脂培养基（3.3）上，36℃±1℃培养48h±2h，从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行生化确证试验。1.2.2　形态观察将挑选纯化的菌落做革兰氏染色（3.4）镜检。粪肠球菌