戊型肝炎病毒中和抗体竞争酶联免疫检测方法的建立及评价

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1、东南大学硕士学位论文戊型肝炎病毒中和抗体竞争酶联免疫检测方法的建立及评价硕士研究生：田华导师：孟继鸿教授王立新副教授『中文摘要1戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一种经粪口途径传播的急性传染病，在世界各地尤其是发展中国家广泛流行，在发达国家也有散发。HE病死率约为O．4％，远较其他各型肝炎高。患者多为青壮年，孕期妇女病死率高达20％[I-2l，给社会带来了很大危害。近年来发现在猪等动物中也有广泛的戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)感染，使该病成为一种人畜共患病【ISl。目前HE尚无特异的治疗方法，也无主动

2、和被动免疫制剂可供预防。国内外学者均在致力于HEV疫苗的研究。而衡量疫苗是否有预防疾病作用的标准，就是看疫苗能否诱导机体产生中和抗体。中和抗体不同于一般的抗体，它能与病毒结构蛋白上的中和抗原表位结合，阻断病毒与敏感细胞的结合，从而阻lE该病毒入侵敏感细胞，使病毒失去感染性，对机体有保护作用，对疾病的诊断、预防和预后起着重要作用。检测中和抗体的常用方法有动物体内试验和细胞培养体外试验两种，但目前对HEV敏感的动物只有非人灵长类动物16J，使用非人灵长类动物建立动物模型，价格昂贵，方法繁琐，试验周期长，动物饲养要求高，耗费大量的人力物

3、力，难以在基层广泛使甩。另外，由于HEV缺乏有效的细胞培养体系．传统的体外中和试验鉴定难以进行，1997年MengIIol铸发明了基于PCR和细胞培养的体外中和试验并用于HEV中和抗体的检测，但该体外中和试验需要细胞培养及RT-PCR技术。方法繁琐，也难以普遍推广应用。针对HEV中和抗体检测存在的问题。本研究的目的是建立一种简便易行的检测HEV中和抗体的方法，并进行初步评价。本研究利用我们先前获得的能够稳定分泌HEV中和性单克隆抗体(MeAb)的杂交瘤细胞株．大量制备和纯化HEV中和性MeAb，并进行酶标记，使待测样本中的HEV中

4、和抗体与酶标记HEV中和性MeAb竞争结合包被抗原上的HEV中和抗原表位，最后根据酶作用底物显色反应减弱的程度，实现对生物学样本中的HEV中和抗体的竞争酶联免疫检测。本研究分为三个部分，具体研究结果如下：一．HEV中和性单克隆抗体的大量制备、鉴定和纯化本实验室通过B淋巴细胞杂交瘤技术，以p166Chn和p166Bur免疫小鼠后获得3株杂交瘤细胞株5G5、lGlo和3Gj。这3株细胞所分泌的McAb均不与单独包被的GST发生结合．是针对HEV的特异性抗体。它们分泌的MeAb能和7种不同基因型来源的p166均发生阳性反应，为p166共

5、同型MeAb。用这3株杂交瘤细胞制备出大量的MeAb，并对MeAb进行了HEV中和活性的鉴定，证实它们具有中和HEV的作用，是HEV中和性MeAb·分别用正辛酸法，DEAE52阴离子交换层析法，Protein-G亲和层析法3种不同的方法对MeAb进行纯化，并对这3种纯化方法的结果进行比较。我们将纯化得到的产物系列稀释后进行间接ELISA检测抗体滴度，显示出用正辛酸法和Protein·G亲和层析的方法纯化的MeAb滴度比DEAE52阴离子交换层析法高，分别可达l：100(5G5)tl：10’(1Glo)l：10’(3GI)。经SDS

6、，PAGE．纯化后的MeAb仅在重、轻链位置出现明显条带，表明纯化后的MeAb纯中文摘要度较高。最终选用较经济、简便的正辛酸法来纯化McAb，选用抗体滴度高，纯度高的McAb5G5作为下一步酶标记的McAb。二．HEV中和性单克隆抗体的酶标记采用改良的过碘酸纳法用辣根过氧化物酶(HRP)标记McAb5G5。成功的制备出了高质量的HRP酶标记McAb5G5。以不同基因型和弧型HEV重组抗原p166的混合物p166Mix为包被抗原，用直接ELISA法检测HRP5G5，方阵滴定的结果显示，当抗原稀释度为1：500，HRP-5G5稀秆度为

7、1：400时．013450最接近于1．O。经过计算，标记物中HRP的含量为0．42mg／mh5G5含鼍为0．34mg／ml：酶／抗体摩尔比为1．4：1。三．HEV中和抗体竞争酶联免疫检测方法的建立及评价我们用p166Mix抗原和中和性MeAbHRP5G5，建立了HEV竞争ELISA的方法，检测抗．HEV中和性抗体。确定最佳包被抗原稀释度为l：800。选择合适的抗原包被液为pH9．6的0．05M碳酸盐缓冲液。酶标微孔板为深圳国产产品。酶标抗体HRP一5G，的最适稀释度为1：400。酶标抗体稀释液为0．01MPBS溶液。标本用量为50

8、ul血清标本。以本方法检铡HEVORF2重组蛋白疫苗免疫的恒河猴系列血清，免疫组自免疫4周开始，血清抗一HEV中和抗体有明显升高，并于8-9周后达到高峰，于6周左右开始中和抗体竞争抑制率>／50％。对照组自病毒攻击4周后血清抗．HEV中和抗体开始升